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1 Organisatorisches Welche Angaben werden für die Bearbeitung von Anfragen benötigt? Vorname & Nachname -adresse Modul Wochentag Alle Antworten sind richtig!!!!!

2 Prüfungen Zwei-Fach Bachelor & Bachelor Berufskolleg: Klausur am 27. Juli Bachelor of Science: Zwei von drei Fächern, Inhalt der Vorlesungen, Min Prüfer Botanik: Finkemeyer, Kudla, von Schaewen Prüfer Mikrobiologie: Fetzner, Meinhardt, Philipp, Steinbüchel Prüfer Zoologie: Klämbt, Lammel, Paul, Weber, Zeis

3 Prüfungen Bachelor of Science: Zwei von drei Fächern, Inhalt der Vorlesungen, Min Nach Bekanntgabe der Termine ist Änderung nur noch möglich: - aus wichtigem Grund - mit Tauschpartner - bis Mitte Juni Prüfungsunterlagen 2 Wochen vor Ihrem ersten Prüfungstermin im Dekanat abholen und zu den Prüfungen mitbringen.

4 Zellbiologie und Physiologie Woche 3 ( ) Bettina Zeis Institut für Zoophysiologie Eva Klumpen, Christian Lischka, Chrishanti Lowe, Toni Weinhage Enzymatische Metabolitbestimmung

5 Enzymatische Laktatbestimmung 1. Der biologische Hintergrund funktionelle Anaerobiose Laktatakkumulation Energiestoffwechsel unter Sauerstoffmangel 2. Der methodische Hintergrund Lambert-Beer sches Gesetz & Photometrie enzymatische Metabolitbestimmung

6 Energiestoffwechsel Proteine Aminosäuren NH 3 Harnstoff cyclus O 2 Alanin Atmungskette Kohlenhydrate Glykolyse Pyruvat Acetyl-CoA NADH Fette Glycerin, Fettsäuren ß-Oxidation Citratcyclus ADP ATP

7 Glykolyse Glucose 2 ADP +P i NAD + 2ATP NADH+H + Pyruvat Substratketten- Phosphorylierung Voet & Voet: Biochemie VCH 1994

8 Atmungskette = oxidative Phosphorylierung O 2 I NADH-Ubichinon-Reduktase II Succinat-Ubichinon-Reduktase III Ubichinon-Cytochrom-c-Reduktase IV Cytochrom-C-Oxidase V ATP-Synthase, F 0 F 1 -ATPase Energieausbeute Glycolyse + Citratcyclus + Atmungskette: 38 (36) ATP je Glucose

9 Energiestoffwechsel NAD + NAD + NAD + NADH NADH+H + +H + Kohlenhydrate Glucose Glykolyse Pyruvat 2 ADP +P i 2ATP L-Laktat LDH O 2 Atmungskette ADP ATP Laktatdehydrogenase Acetyl-CoA NADH NAD Citratcyclus

10 Funktion der Milchsäuregärung 1. Entfernen des Glykolyse-Endproduktes Pyruvat 2. Oxidation von NADH zu NAD (Regeneration des Elektronenakzeptors NAD) Ablauf der Glykolyse unter anaeroben Bedingungen, ATP-Gewinnung

11 Laktatdehydrogenase Nativ als Tetramer Je UE ca. 330 aa 36 kda Stereospezifität Voet & Voet: Biochemie VCH 1994

12 Laktatdehydrogenase COO - HO-C-H CH3 LDH COO - C=O CH3 Laktat + NAD + Pyruvat + NADH + H + Reduktion Oxidation In der Zelle

13 Energiegewinnung unter Sauerstoffmangel 1. Funktionsbedingte Anaerobiose Exzessive Muskeltätigkeit (Endspurt bei Beutejagd, Fluchtreaktionen) Sauerstoff ist vorhanden, reicht aber nicht aus Atmungskette und Citratcyclus laufen auf Hochtouren Kapazität der Atmungskette ist überschritten, Blutkreislauf kann trotz erhöhter Perfusion nicht schnell genug Sauerstoff nachliefern kurzfristige Bereitstellung von ATP durch zusätzliche Milchsäuregärung 2. Biotopbedingte Anaerobiose Sauerstoffmangel im Umgebungsmedium (z.b. eutrophierte Gewässer, große Höhe) Sauerstoff steht nicht zur Verfügung, Atmungskette und Citratcyclus kommen zum Erliegen Reaktion: Stoffwechselabsenkung (metabolic depression) langfristig Energiegiegewinnung durch alternative Stoffwechselwege möglich Akkumulation von Laktat, Succinat, Acetat, Propionat, Opinen

14 Cori Zyklus

15 Enzymatische Laktatbestimmung 1. Der biologische Hintergrund funktionelle Anaerobiose Laktatakkumulation Energiestoffwechsel unter Sauerstoffmangel 2. Der methodische Hintergrund Lambert-Beer sches Gesetz & Photometrie enzymatische Metabolitbestimmung

16 Laktatdehydrogenase COO - HO-C-H CH3 LDH COO - C=O CH3 Laktat + NAD + Pyruvat + NADH + H + Oxidation Reduktion Enzymatische Laktatbestimmung

17 Lichtabsorption von NAD/NADH NAD + Voet & Voet: Biochemie VCH 1994 NADH

18 Lambert-Beer sches Gesetz Licht h. n Lösung des Chromophors ankommendes Wellenlänge g mit Konzentration c Licht I o Schichtdicke (d) 1 cm I I I o -2,303 e. c. d = e Extinktion E = log I o I = e. c. d Transmission: 100. I / I o (Angabe in %) Extinktionskoeffizient e für NADH: e 340 nm = 6,3 l. mmol -1. cm -1

19 Zeitverlauf enzymatischer Reaktionen 1,00 E 0,75 0,50 Enzymzugabe DE Dc = DE e * d 0,25 0, Zeit (min)

20 Der Praktikumsversuch Laktatakkumulation nach funktioneller Anaerobiose Bestimmung der Laktatkonzentration in der Hämolymphe der Strandkrabbe Carcinus maenas vor und nach erschöpfender Muskelaktivität unterschiedlicher Dauer GGruppe Aktives Tier: Hämolymphentnahme nach 1 / 2 2 min 3 / 4 4 min 5 / 6 6 min 7 / 8 7 min Je Gruppe: 1 Ruhewert ohne Aktivität (0 min) 1 Wert nach Aktivität vom gleichen Tier 9 / 10 8 min 11/12 9 min

21 Durchführung - Hämolymphabnahme (Spritzen und Kanülen am Arbeitsplatz liegen lassen) - Hitzedenaturierung der Proteine (Thermoblock 10 min) - Zentrifugation (10 min rpm) Pellet: denaturierte Eiweiße, Zellfraktionen Überstand: niedermolekulare Metabolite - enzymatische Laktatbestimmung

22 Photometrische Messung 1. Leerwert: Extinktionsänderung ohne Laktat 2. Standard, Kalibrierung (Messung bekannter Laktatkonzentrationen) 3. Lösung unbekannter Laktatkonzentrationen (Hämolymphproben)

23 Photometrische Messung Leerwert Standard Probe Puffer 860 µl 860 µl 860 µl NAD 20 µl 20 µl 20 µl Wasser 100 µl ad 100 µl ad 100 µl Standard 10/20/30 µl Probe 10/20 µl E vorher LDH 20 µl 20 µl 20 µl 1 h 37 C E nachher

24 Der Praktikumsversuch Laktatakkumulation nach funktioneller Anaerobiose Bestimmung der Laktatkonzentration in der Hämolymphe der Strandkrabbe Carcinus maenas vor und nach erschöpfender Muskelaktivität unterschiedlicher Dauer Gruppe Ruhewert Laktat (mmol/l) Null Aktivität Aktivitätsdauer (Minuten) 1/2 1 3/4 2 5/6 3 7/8 4 9/ /12 8 Nach Aktivität Laktat (mmol/l) Je TISCH: 1 Ruhewert ohne Aktivität (0 min) 1 Wert nach Aktivität vom gleichen Tier

25 Protokoll: 1. Einleitung 2. Material und Methoden 3. Ergebnisse Tabelle Original-Messwerte (eigene Gruppe) Kalibrierungsgerade (Diagramm und Geradenfunktion, eigene Gruppe) Berechnete Laktatkonzentration der Hämolymphproben (eigene Gruppe) Tabelle der Ergebnisse aller Gruppen Beschreibung der Ergebnisse in Textform Grafik des Zeitverlaufs 4. Diskussion

26 Länge (mm) Standard für grafische Darstellungen: XY-Plot! Lineare Achsen! Achsenbeschriftung: Parameter und Einheit! Länge (mm) ,5 2 2, Alter (Tage) Alter (Tage)

27 Protokollstandards Legenden - befinden sich oberhalb von Tabellen unterhalb von Abbildungen - fassen die Aussage der Abbildung (Tabelle) zusammen: Welche Parameter wurden untersucht? Was ist das Hauptergebnis?

28

29 Citratcyclus Voet & Voet: Biochemie VCH 1994

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