SOP_018_Glucosebestimmung

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1 SOP_018_Glucosebestimmung Inhalt Version erstellt am erstellt durch freigegeben durch D Glucosebestimmung in Fermentationsproben Laborpraxis Frank Eiden mittels UV - Test Einsatzgebiet: UV Test zur Bestimmung von D-Glucose in Fermentationsproben, Zellkulturmedien und anderen Probematerialien. Inhalt: 1. Theoretischer Hintergrund 2. Material und Methoden 3. Durchführung 4. Auswertung 5. D-Glucose-Testkontroll-Lösung 6. Literatur 1

2 1 Theoretischer Hintergund Kohlenhydrate können als Enantiomere vorliegen. Für Glucose gibt es zwei Varianten, D-Glucose und L-Glucose. In der Natur kommt ausschließlich D-Glucose vor, der üblicherweise als Traubenzucker bezeichnet wird. Chemisch gesehen handelt es sich bei D- Glucose um ein C6-Körper mit der Summenformel C 6 H 12 O 6, einer Aldehydgruppe am C 1 - Atom und einer rechtsstehenden Hydroxylgruppe am C 5 - Chiralitätszentrum. Die Formulierung D-(+)-Glucose gibt rechtsdrehende Eigenschaften der Schwingungsebene von linear polarisierten Licht in Lösungen an. Eine weitere Eigenschaft von D-Glucose ist die Bildung eines Halbacetals, durch Reaktion der Aldehydgruppe und der C 5 -Hydroxylgruppe derselben Aldose. Hierbei kommt es zur Bildung eines Sechsrings, der Pyranose. Glucose erfüllt eine ganze Reihe unterschiedlicher Funktionen. Wichtigste ist die Energielieferung im Stoffwechsel der meisten Mikroorganismen, dem enzymatischen Abbau von D-Glucose zu C 3 -Körper, meist Pyruvat im Prozess der Glykolyse mit einer Energieausbeute von 2 Molekülen ATP pro Glucose. Weiterer Abbau der Stoffwechselprodukte entweder durch vollständigen oxidativen Abbau oder unter anaeroben Bedingungen in Form der Gärung Glucose ist ein bedeutender Rohstoff für die Biotechnologie. Sie dient in großem Maße als Ausgangsprodukt für die Synthese von biologisch technisch erzeugten Produkte, wie z.b. Ethanol. Ihre quantitative Analyse während Fermentationsversuche ist daher ein zentraler Aspekt im Hinblick auf die Optimierung von Fermentationsprozessen. 2

3 2 Material / Methoden Die Bestimmung von D-Glucose erfolgt über ein Testkit der Firma Roché. Es handelt sich hierbei um eine photometrische Analyse im Bereich ultravioletter Spektren. Prinzip: D-Glucose wird durch Hexokinase und ATP zu D-Glucose-6-phosphat und ADP phosphoryliert. Unter Anwesenheit von Glucose-6- phosphat-dehydrogenase wird Glucose-6-phosphat von Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat (NADP) zu D-Gluconat-6-phosphat oxidiert, unter gleichzeitiger Reduzierung von NADP + zu NADPH+H +. Die während der Reaktion gebildete Menge an NADPH+H + ist proportional zur D-Glucosekonzentration. Material: Testkit: - Flasche 1 enthält Trieethanolamin-Puffer, NADP, ATP und Magnesiumsulfat - Flasche 2 enthält Hexokinase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase - Flasche 3 D-Glucose Testkontroll Lösung Anstelle von Glasküvetten sind ggf. auch handelsübliche Einwegküvetten mit einer Schichtdicke von 1 cm geeignet. Das Absortptionsmaximum von NADPH liegt bei 340 nm. Bei Verwendung von Spektralphotometern wird im Absorptionsmaximum, bei Verwendung von Spektral-Linienphotometer mit Hg-Dampflampe wird bei einer Messstrahlung von 365 nm oder 334 nm gemessen. 3

4 3. Durchführung 3.1 Herstellen der Lösungen 1. Inhalt einer Flasche 1 mit 45ml bidest. Wasser lösen und vor Gebrauch auf C bringen. 2. Inhalt einer Flasche 2 unverdünnt verwenden. 3.2 Stabilität der Reagenzien Der Inhalt einer rekonstruierten Flasche 1 ist bei 2-8 C 4 Wochen, bei -15 bis -25 C 2 Monate haltbar. Der Inhalt einer Flasche 2 ist stabil bei 2-8 C (s.packungsetikett). 3.3 Bestimmungsparameter Wellenlänge: 340nm, Hg 365nm oder Hg334nm Küvette: 1 cm Schichtdicke Temperatur: C Testvolumen: 3,020 ml 3.4 Durchführung Allgemeine Hinweise zur Testdurchführung Im Testansatz muss die D-Glucosemenge zwischen 1 μg und 50 μg betragen. Zur Erzielung einer ausreichend hohen Extinktionsdifferenz ( s. Auswertung ) ist die Probelösung soweit zu verdünnen, dass die die D-Glucosekonzenration zwischen 0,15 und 1,0 g/l bzw. 0,08 und 0,5 g/l liegt, vgl. Tabelle 1. Analysenprobe, ggf. nach Zentrifugation, zum Abstoppen enzymatischer Vorgänge mind. 15 min in Wasserbad ( ) stellen und anschließend zentrifugieren. Überstand zur Analyse gemäß Verdünnungstabelle verdünnen. 4

5 Tabelle 1: Verdünnungstabelle Tabelle 2: Testdurchführung * Vor der Dosierung der Probelösung Enzymtest-Messpipette bzw. Pipettenspitze der Kolbenhubpipette mit der Probelösung vorspülen **Z.B. mit Rührspatel oder durch Umschwenken nach Verschließen z.b. mit Parafilm Wurden beie 2 konstante Extinktionszunahmen festgestellt, werden die Extinktionen auf die Zeit der Zugabe von Suspension 2 extrapoliert. Für Leerwert und Probe Extinktionsdifferenzen (E 2 -E 1 ) berechnen. Extinktionsdifferenz des Leerwertes von Extinktionsdifferenz der Probe abziehen. Die gemessene Extinktionsdifferenzen sollten zur Erzielung eines ausreichend präzisen Ergebnisses in der Regel mind. 0,100 Extinktionseinheiten betragen. 5

6 4 Auswertung Tabelle 3: Berechnung der D-Glucosekonzentration 5 D-Glucose Kontroll Testlösung Zur Plausibilitätskontrolle der Testreihe kann eine Testlösung mit bekannter D-Glucosekonzentration (s.flaschenetikett) mitgeführt werden. Die Testkontroll-Lösung wird anstelle der Probelösung zur Bestimmung eingesetzt. Es handelt sich hierbei um eine stabilisierte wässrige Lösung. Die Konzentrationsangabe bezieht sich auf wasserfreie D Glucose. 6

7 6 Literatur Testkit D Glucose, BOEHRINGER MANNHEIM / R-BIOPHARM, Enzymatische BioAnalytik / Lebensmittelanalytik Firma Roché 7