DISSERTATION zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) der Fakultät für Chemie der Universität Bielefeld

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1 Spektroskopische Untersuchungen zur Aufklärung der Transportmechanismen eines Glutamattransporters und eines zyklisch- Nukleotid gesteuerten Ionenkanals DISSERTATION zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) der Fakultät für Chemie der Universität Bielefeld vorgelegt von Anne Kathrin Zuber aus Düsseldorf Bielefeld, 2008

2 Promotionsgesuch eingereicht am Gutachter: Professor Joachim Heberle 2. Gutachter: Professor Gabriele Fischer von Mollard Aus dieser Arbeit ist folgende Veröffentlichung entstanden: Jiang, X., Zuber, A., Heberle, J., Ataka, K. (2008) In situ monitoring of the orientated assembly of strep-tagged membrane proteins on the gold surface by surface-enhanced infrared absorption spectroscopy. Phys.Chem.Chem.Phys., 10,

3 Berichte aus der Biophysik Anne Kathrin Zuber Spektroskopische Untersuchungen zur Aufklärung der Transportmechanismen eines Glutamattransporters und eines zyklisch-nukleotid gesteuerten Ionenkanals Shaker Verlag Aachen 2009

4 Bibliografische Information der Deutschen Nationalbibliothek Die Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über abrufbar. Zugl.: Bielefeld, Univ., Diss., 2008 Copyright Shaker Verlag 2009 Alle Rechte, auch das des auszugsweisen Nachdruckes, der auszugsweisen oder vollständigen Wiedergabe, der Speicherung in Datenverarbeitungsanlagen und der Übersetzung, vorbehalten. Printed in Germany. ISBN ISSN Shaker Verlag GmbH Postfach Aachen Telefon: / Telefax: / Internet: info@shaker.de

5 Vorwort Die vorliegende Arbeit entstand während meiner Tätigkeit als wissenschaftliche Mitarbeiterin im Zeitraum von November 2004 bis Februar 2006 am Institut für Neurowissenschaften und Biophysik (INB-2) vormals Institut für Biologische Strukturforschung (IBI-2) im Forschungszentrum Jülich und vom März 2006 bis November 2008 am Institut für Biophysikalische Chemie (PC III) der Universität Bielefeld unter der Anleitung von Herrn Professor Joachim Heberle. Meinem Doktorvater, Herrn Professor Joachim Heberle, dessen wissenschaftliche Neugier der Ursprung dieser Arbeit war, danke ich im hohen Maße. Seine Anregungen sowie die Unterstützung seines Lehrstuhls haben entscheidend zur Fertigstellung beigetragen. Ebenso möchte ich mich bei Frau Professor Gabriele Fischer von Mollard für die Übernahme des Zweitgutachtens bedanken. Herrn Professor Christoph Fahlke, Herrn Professor Benjamin Kaupp und ihren Arbeitsgruppen bin ich für die Gastfreundschaft und Lehrbereitschaft während meiner Aufenthalte in ihren Laboratorien zu Dank verpflichtet. Bedanken möchte ich mich bei meinen Kollegen und ehemaligen Kollegen. Durch zahlreiche Diskussionen und praktische Unterstützungen konnte ich wertvolle Anregungen und Hilfestellungen für meine Arbeit erhalten. Herausheben möchte ich Frau Sandra Gericke, Frau Anna Pfeifer und Frau Melanie Nack, sowie Frau Dr. Sofia Kapetanaki und Frau Dr. Teresa Majerus, die immer Zeit für motivierende Gespräche hatten. Ganz besonders danke ich meinen Freunden und meiner Familie, die mich während meiner gesamten Ausbildungszeit unterstützt, mir den Rücken gestärkt und somit die nötigen Freiräume geschaffen haben. Meinem lieben Mann Daniel gilt mein größter Dank. Ohne seinen Zuspruch, seine Geduld und seinen Optimismus wäre die Fertigstellung dieser Dissertation schlichtweg nicht möglich gewesen. Meinem Vater, der an meiner Promotion nicht mehr teilhaben konnte, widme ich diese Arbeit. Wuppertal, im Dezember 2008 Anne Zuber

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7 Inhaltsverzeichnis I 1 EINLEITUNG 1 2 MEMBRANPROTEINE Glutamattransporter Zyklisch-Nukleotid gesteuerte Ionenkanäle 8 3 METHODEN DER SPEKTROSKOPIE Methoden im UV-Vis-Bereich Fluoreszenzspektroskopie Zirkulardichroismus (CD) Messungen im IR-Bereich Ligandeninduzierte FTIR-Differenzspektroskopie mittels abgeschwächter Totalreflexion (ATR) Ligandeninduzierte FTIR-Differenzspektroskopie mittels photolabiler Substanzen Spannungsinduzierte FTIR-Differenzmessung mittels oberflächenverstärkter IR-Spektroskopie 25 4 CHARAKTERISIERUNG DER MEMBRANPROTEINE Reinheit und Masse der Proteine Der Glutamattransporter aus E. coli Reinigung des Membranproteins Immunochemischer His-Tag-Nachweis Bestimmung des Molekulargewichtes des Transporters mittels ESI-MS Zusammenfassung der biochemischen Charakterisierung des ecgltps Der zyklisch-nukleotid gesteuerte Ionenkanal aus M. loti Reinigung des Volllängenmembranproteins (CNG) Reinigung der löslichen zyklischen Nukleotid-Bindedomäne (CNBD) Funktionalitätstests Untersuchungen an dem Glutamattransporter aus E. coli ³H-Glutamat-Transport Fluoreszenz-Messung CD-Messung Zusammenfassung der Funktionalitätstests des Glutamattransporters Untersuchungen an dem Ionenkanal und an der isolierten Bindedomäne Bindungsnachweis mittels der Fluoreszenzsonde 8-NBD-cAMP CD-Spektroskopie Zusammenfassung des Bindungsnachweis von camp an CNG und CNBD 46

8 II Inhaltsverzeichnis 5 FTIR-DIFFERENZSPEKTROSKOPIE Ligandeninduzierte FTIR-Differenzspektroskopie mittels ATR-Technik Untersuchungen an dem Glutamattransporter aus E. coli Untersuchungen an dem Ionenkanal aus Mesorhizobium loti Zusammenfassung der Ergebnisse der ATR-Differenzspektroskopie Ligandeninduzierte FTIR-Differenzspektroskopie mittels photolabiler Substanzen Untersuchung der Freisetzung des DCNB-Glutamats Untersuchungen am Ionenkanal (CNG) und der Bindedomäne (CNBD) Zusammenfassung Spannungsinduzierte FTIR-Differenzspektroskopie Untersuchungen des Glutamattransporters Untersuchungen des Ionenkanals Zusammenfassung 69 6 DISKUSSION Der Glutamattransporter Der Ionenkanal (CNG) und seine Bindedomäne (CNBD) 74 7 ZUSAMMENFASSUNG 80 8 ANHANG Der Glutamattransporter aus E.coli Chemische Transformation Kultivierung von E. coli BL21 (DE3) pask IBA5(15) ecgltp(-his) Gewinnung des Membranpellets Herauslösen der Membranproteine und Reinigung des ecgltps Einbringen des Transporters in eine Lipidumgebung (Rekonstitution) Der zyklisch-nukleotid gesteuerte Ionenkanal (CNG) aus M. loti Aufschluss der Zellen und Herauslösen der Membranproteine Reinigung des Ionenkanals Entfernung des zyklischen Adenosinmonophosphats (camp) aus CNG Einbringen des Ionenkanals in Lipidumgebungen (Rekonstitution) Gewinnung der zyklischen Nukleotid-Bindedomäne (CNBD) Reinigung der zyklischen Nukleotid-Bindedomäne Entfernung des zyklischen Adenosinmonophosphats aus der CNBD 88

9 Inhaltsverzeichnis III 8.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Spezifischer Proteinnachweis mittels Western Blot Größenausschlusschromatographie Elektronenspray-Ionisation-Massenspektrometrie (ESI-MS) Aktivitätstest ³H-Glutamattransport in Vesikel Fluoreszenzbindungstest an den Ionenkanal und die Bindedomäne 91 9 LITERATURVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 99