Phosphohistone H3 (PHH3)

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1 Rev. 1.0 Phosphohistone H3 (PHH3) Rabbit Polyclonal Antibody PRODUKTVERFÜGBARKEIT Kat.- Nr. Beschreibung 369A-14 0,1 ml, Konzentrat 369A-15 0,5 ml, Konzentrat 369A-16 1,0 ml, Konzentrat 369A-17 1,0 ml, Vorverdünnung gebrauchsfertig 369A-18 7,0 ml, Vorverdünnung gebrauchsfertig 369S Positive Kontrollobjektträger, 5 Objektträger/Packung DEFINITION DER SYMBOLE P Vorverdünnung E Serum C Konzentrat DIL Verdünnungsbereich des Konzentrats A Aszites Balkencode S Überstand VERWENDUNGSZWECK Dieser Antikörper ist für die Verwendung in der In-vitro-Diagnostik (IVD) bestimmt. Der Cell Marque Phosphohistone H3 (PHH3) (Polyclonal) Antikörper ist für qualifizierte Laboratorien zur qualitativen Feststellung assoziierter Antigene durch Lichtmikroskopie in formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeabschnitten unter Verwendung von IHC-Testmethoden bestimmt. Die Verwendung dieses Antikörpers ist bei der Identifizierung von mitotischer Aktivität in Tumorzellen sowie bei der Unterscheidung von Tumoren unter Berücksichtigung eines Antikörper-Panels, der von einem qualifizierten Pathologen vorgenommenen Anamnese des Patienten und anderer Diagnoseverfahren indiziert. ZUSAMMENFASSUNG UND ERKLÄRUNG Phosphohistone H3 (PHH3) ist ein Haupt-Histonprotein, das gemeinsam mit anderen Histonen die Protein-Hauptbestandteile des Chromatins in eukaryotischen Zellen bildet. Phosphohiston H3 ist bei Säugetieren während der Interphase unbedeutend, erreicht jedoch während der Mitose eine maximale Chromatin-Kondensation. 1 Immunhistochemische Studien haben gezeigt, dass insbesondere Anti-PHH3 das Haupt-Histonprotein H3 nur dann erkannte, wenn die Phosphorylierung bei Serin 10 oder Serin 28 erfolgte. Außerdem zeigten die Studien keine Phosphorylierung am Histon H3 während der Apoptose. 2 Daher kann PHH3 als mitotischer Marker dienen, um mitotische Zellen von apoptotischen Körperchen und Resten des karyorrhektischen Kernzerfalls zu unterscheiden, was ein äußerst nützliches Hilfsmittel bei der Diagnose von Tumorgraden sein kann, insbesondere in den Bereichen des zentralen Nervensystems, Haut, Gynäkologie, Weichgewebe und GIST. 3,4,5 PRINZIPIEN UND VERFAHREN Anti-Phosphohistone H3 (PHH3) (Polyclonal) kann als Primärantikörper für die immunhistochemische Färbung von formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeschnitten verwendet werden. Im Allgemeinen erlaubt die immunhistochemische Färbung in Verbindung mit einem Streptavidin-Biotin-Nachweissystem die Visualisierung von Antigenen durch die aufeinanderfolgende Anwendung eines spezifischen Antikörpers (Primärantikörper) gegen das Antigen, eines Sekundärantikörpers (Link-Antikörper) gegen den Primärantikörper, eines Enzymkomplexes und eines Chromogensubstrats mit dazwischen liegenden Waschschritten. Alternativ kann auch ein Biotin-freies polymeres Nachweissystem verwendet werden. Die enzymatische Aktivierung der Chromogen-Resultate führt zu einem sichtbaren Reaktionsprodukt am Antigenort. Die Probe kann anschließend gegengefärbt und eingedeckt werden. Die Ergebnisse werden mit einem Lichtmikroskop und mit Hilfe der Differenzialdiagnose pathophysiologischer Prozesse interpretiert, die mit einem bestimmten Antigen assoziiert sein könnten. Anti-Phosphohistone H3 (PHH3) (Polyclonal) vorverdünnte Produkte sind zum Gebrauch mit Cell Marque Nachweiskits optimal verdünnt, obwohl sie vielfach auch mit einer Vielzahl von Nachweiskits anderer Hersteller erfolgreich angewendet werden.

2 MATERIALIEN UND VERFAHREN Im Lieferumfang enthaltene Reagenzien Vorverdünntes Phosphohistone H3 (PHH3) (Polyclonal) Primärantikörper-Produkt enthält gebrauchsfertiges Reagenz. Konzentriertes Phosphohistone H3 (PHH3) (Polyclonal) Primärantikörper-Produkt enthält konzentriertes Reagenz. Sowohl die vorverdünnte als auch die konzentrierte Form dieses Antikörpers werden in trisgepufferter Kochsalzlösung (ph ) mit 1 % BSA und <0,1 % Natriumazid verdünnt. Sowohl die Immunoglobulinkonzentration des vorverdünnten als auch die des konzentrierten Reagenzes ist auf dem Produktetikett angegeben. Einzelheiten zur Antikörperquelle finden Sie auf dem Produktetikett. Rekonstitution, Mischung, Verdünnung, Titrierung Der vorverdünnte Antikörper ist gebrauchsfertig und wurde für die Färbung optimiert. Es ist keine Rekonstitution, Mischung, Verdünnung oder Titrierung erforderlich. Der konzentrierte Antikörper wurde optimiert, um innerhalb des auf dem Produktetikett angegebenen Verdünnungsbereichs verdünnt zu werden. Der Benutzer muss die Arbeitsverdünnung des konzentrierten Produkts validieren. Unterschiede in der Vorbereitung der Gewebeproben und bei den technischen Laborverfahren können zu deutlichen Unterschieden bei den Testergebnissen führen und demzufolge regelmäßige Kontrollen erfordern. (siehe Abschnitt Verfahren zur Qualitätskontrolle) Nicht im Lieferumfang enthaltene erforderliche Materialien und Reagenzien Die folgenden Reagenzien und Materialien können für das Färbeverfahren erforderlich sein, sind aber nicht im Lieferumfang des Primärantikörpers enthalten: 1. Positive und negative Kontrollgewebe 2. Mikroskop-Objektträger, positiv geladen 3. Trockenschrank mit der Leistung zur Aufrechterhaltung einer Temperatur von C ± 5 C 4. Färbeschalen oder Wannen 5. Timer 6. Xylol oder Xylolersatz 7. Ethanol oder Reagenzalkohol Hinweis: Einstufige Vorbehandlung von Cell Marque, Trilogy (Kat.- Nr. 920P-06), kann sowohl Punkt 6 als auch Punkt 7 ersetzen. 8. Entionisiertes oder destilliertes Wasser 9. Elektrischer Dampftopf (Kat.- Nr. 976L) für Gewebevorbehandlung 10. Nachweissystem (wie z. B. Kat.- Nr. 954D-20) und Chromogen (wie z. B. Kat.- Nr. 957D-20) 11. Waschlösungen (Kat.- Nr. 935B-09) 12. Hematoxylin (Kat.- Nr. 930B-05) oder eine andere Gegenfärbung 13. Antikörperverdünnungen (wie z. B. Kat.- Nr. 938B-05) 14. Peroxid-Block (Kat.- Nr. 925B-05) zum Gebrauch mit HRP 15. Avidin-Biotin-Block (Kat.- Nr. 928B-02 zum Gebrauch mit dem Streptavidin-Biotin-Nachweis) 16. Negatives Kontrollreagenz (Kat.- Nr. 932B-02 für Maus; Kat.- Nr. 933B-02 für Kaninchen) 17. Fixiermittel (Kat.- Nr. 931B-03) 18. Deckgläser 19. Lichtmikroskop (40 400fache Vergrößerung) Lagerung und Handhabung Bei 2 8 C lagern. Nicht einfrieren. Um die ordnungsgemäße Abgabe der Reagenzien und die Stabilität des Antikörpers zu erhalten, nach jedem Durchlauf Spender- Verschlusskappe wieder aufsetzen und die Flasche sofort in aufrechter Position in den Kühlschrank stellen. Jedes Antikörper-Reagenz ist mit einem Verfallsdatum versehen. Bei korrekter Aufbewahrung ist das Reagenz bis zu dem auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatum stabil. Reagenz nach Ablauf des Verfallsdatums für die angegebene Lagermethode nicht mehr verwenden. Es gibt keine offensichtlichen Anzeichen bei Instabilität der Reagenzien. Aus diesem Grund müssen immer gleichzeitig positive und negative Kontrollgewebe zusammen mit unbekannten Proben gefärbt werden. Setzen Sie sich mit dem Kundendienst von Cell Marque in Verbindung, wenn Anzeichen von Reagenz-Instabilität bestehen. Entnahme und Vorbereitung der Proben zur Analyse Entsprechend der Laborroutinemethode aufgearbeitete, neutralgepufferte formalinfixierte, paraffineingebettete Gewebeproben sind zur Verwendung mit diesem Primärantikörper geeignet, wenn sie in Verbindung mit Cell Marque-Nachweiskits eingesetzt werden (siehe Abschnitt Nicht im Lieferumfang enthaltene erforderliche Materialien und Reagenzien ). Hinweis: Mit Cell Marque kann nur die Leistung bei menschlichem Gewebe bewertet werden. Das empfohlene Gewebefixiermaterial ist 10 % neutral-gepuffertes Formalin. Infolge verlängerter Gewebefixierung oder besonderer Prozesse wie einer Dekalzifaktion bei der Vorbereitung des Knochenmarks können unterschiedliche Ergebnisse auftreten. Jeder Schnitt muss die geeignete Stärke aufweisen (ca. 3 μm) und auf einen positiv geladenen Glasobjektträger aufgebracht werden. Die mit Gewebeschnitten bestückten Objektträger können mindestens 2 Stunden (nicht länger als 24 Stunden) bei C ± 5 C im Ofen angebacken werden. WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN 1. Bei der Arbeit mit den Reagenzien angemessene Vorsichtsmaßnahmen treffen. Bei der Handhabung von krebserregenden oder toxischen Substanzen (z. B. Xylol) Einweg- Handschuhe und -Laborkittel tragen. 2. Kontakt mit Augen und Schleimhäuten vermeiden. Bei Kontakt von Reagenzien mit empfindlichen Körperteilen mit reichlich Wasser ausspülen. 3. Patientenproben und alle Materialen, die mit diesen in Berührung gekommen sind, sind als biogefährliche Materialien zu behandeln und müssen unter Einhaltung der entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen entsorgt werden. Niemals mit dem Mund pipettieren. 4. Mikrobielle Kontamination der Reagenzien vermeiden, dies kann zu fehlerhaften Versuchsergebnissen führen. 5. Der Benutzer muss die Inkubationszeiten und Temperaturen validieren. 6. Die vorverdünnten, gebrauchsfertigen Reagenzien sind optimal verdünnt, und eine weitere Verdünnung kann zu einem Nachlassen der Antigenfärbung führen. Phosphohistone H3 (PHH3) (Polyclonal) S. 2

3 7. Die konzentrierten Reagenzien können auf der Grundlage der Validierung durch den Benutzer optimal verdünnt werden. Jedes verwendete Verdünnungsmittel, das hier nicht speziell empfohlen wird, muss ebenfalls durch den Benutzer sowohl hinsichtlich seiner Kompatibilität als auch seiner Auswirkungen auf die Stabilität validiert werden. 8. Dieses Produkt ist bei sachgemäßer Verwendung nicht als Gefahrstoff eingestuft. Das Konservierungsmittel in dem Reagenz ist weniger als 0,1 % Natriumazid und erfüllt bei der angegebenen Konzentration nicht die Kriterien für einen Gefahrstoff gemäß OSHA (USA). Siehe MSDS. 9. Der Benutzer muss Lagerbedingungen, die sich von den in der Packungsbeilage angegebenen Bedingungen unterscheiden, validieren. 10. Das Verdünnungsmittel kann Rinderserum-Albumin und der Überstand kann Rinderserum enthalten. Die Produkte, die fetales Rinderserum bzw. Rinderserum-Albumin enthalten, stammen von kommerziellen Anbietern. Die Ursprungszertifikate für die bei diesen Produkten verwendete Tierquelle werden bei Cell Marque aufbewahrt. Aus den Zertifikaten geht hervor, dass die Rinderquellen sich in Ländern befinden, die ein zu vernachlässigendes BSE-Risiko aufweisen, und es werden Quellen von Rindern aus den USA und Kanada angegeben. 11. Wie bei jedem Produkt, das aus biologischen Quellen stammt, sind auch hier die geeigneten Verfahren zur Handhabung solcher Produkte anzuwenden. GEBRAUCHSANWEISUNG Verfahrensschritte Empfohlene Färbeprotokolle für Phosphohistone H3 (PHH3) (Polyclonal) HiDef Detection System: 1. Entparaffinierung, Rehydrierung und Epitopdemaskierung, wobei die bevorzugte Methode die Verwendung der Techniken der wärmeinduzierten Epitopdemaskierung (HIER) mithilfe der Cell Marque s Trilogy in Verbindung mit einem Dampftopf ist. Die bevorzugte Methode ermöglicht eine gleichzeitige Durchführung von Entparaffinierung, Rehydrierung und Epitopdemaskierung. Anschließend 5 Mal mit destilliertem oder deionisiertem Wasser spülen. 2. Bei Verwendung des HRP-Nachweissystems die Objektträger für 10 Minuten in den Peroxidblock legen und spülen. Bei Verwendung des AP-Nachweissystems diesen Schritt auslassen. 3. Antikörper hinzugeben und 10 bis 30 Minuten lang inkubieren, dann spülen. 4. HiDef Detection -Amplifikator Kaninchen/Maus hinzufügen und 10 Minuten lang inkubieren, dann spülen. 5. Polymerdetektor für 10 Minuten applizieren; spülen. 6. Reichlich Chromogen hinzugeben und 1-10 Minuten lang inkubieren, dann spülen. 7. Dehydrieren und eindecken. VERFAHREN ZUR QUALITÄTSKONTROLLE Positive Gewebekontrolle Zusammen mit jedem Färbedurchlauf muss eine positive Gewebekontrolle mitlaufen. In diesem Gewebe können Zell- oder Gewebebestandteile enthalten sein, die sich sowohl positiv als auch negativ färben und damit als Positiv- wie auch als Negativkontrolle verwendet werden können. Die Kontrollprobe muss aus frischem Gewebe einer Autopsie, Biopsie oder einem chirurgischen Eingriff bestehen und so schnell wie möglich auf identische Weise wie die Probenschnitte präpariert oder fixiert werden. Die Verwendung eines Kontrollschnitts, der auf andere Weise als das Testpräparat fixiert oder präpariert worden ist, dient der Kontrolle für alle Reagenzien und Verfahrensschritte, mit Ausnahme der Fixierung und Gewebepräparierung. Eine Probe mit schwach positiver Färbung ist zur optimalen Qualitätskontrolle und zur Erkennung von geringfügigerem Reagenzienabbau besser geeignet. Die positive Gewebekontrolle für Phosphohistone H3 (PHH3) (Polyclonal) Primärantikörper kann folgende umfassen: Mandeln Nukleär Nachweislich positive Gewebekontrollen dürfen nur zur Kontrolle der korrekten Leistung von verarbeitetem Gewebe und Testreagenzien verwendet werden und nicht als Hilfe bei der Erstellung einer spezifischen Diagnose von Patientenproben. Wenn mit der positiven Gewebekontrolle keine angemessene positive Färbung nachgewiesen werden kann, müssen die Ergebnisse mit den Testpräparaten als ungültig gewertet werden. Negative Gewebekontrolle Für die negative Gewebekontrolle kann das gleiche Gewebe verwendet werden wie für die Positivkontrolle. Die Vielzahl der in den meisten Gewebeschnitten vorkommenden Zellarten bietet Stellen zur internen Negativkontrolle, die allerdings vom Benutzer überprüft werden müssen. Aufgabe der nichtfärbenden Komponenten ist es, das Fehlen spezifischer Färbungen nachzuweisen und auf unspezifische Hintergrundfärbungen hinzuweisen. Bei spezifischer Färbung der negativen Gewebekontrolle müssen die mit den Patientenproben erzielten Ergebnisse als ungültig gewertet werden. Unerklärliche Abweichungen Unerklärliche Abweichungen in Kontrollen sollten sofort dem Kundendienst von Cell Marque gemeldet werden. Wenn die Ergebnisse der Qualitätskontrolle die Spezifikationen nicht erfüllen, sind die Patientenergebnisse ungültig. Siehe Abschnitt Fehlerbehebung in dieser Packungsbeilage. Identifizieren und korrigieren Sie das Problem, und wiederholen Sie anschließend das gesamte Verfahren mit den Patientenproben. Negatives Kontrollreagenz Für jede Probe muss ein negatives Kontrollreagenz mitlaufen, um die Interpretation der Ergebnisse zu unterstützen. Ein negatives Kontrollreagenz wird anstelle der Primärantikörperkontrolle zur Bewertung von unspezifischer Färbung durchgeführt. Der Objektträger sollte mit negativem Kontrollreagenz behandelt werden, das den Phosphohistone H3 (PHH3) (Polyclonal) S. 3

4 Wirtsspezies des Primärantikörpers entspricht und idealerweise über dieselbe IgG-Konzentration verfügt. Die Inkubationsdauer für das negative Kontrollreagenz sollte der für die Primärantikörper geltenden Inkubationsdauer entsprechen. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE Das Immunofärbeverfahren hat ein gefärbtes Reaktionsprodukt zur Folge, das an den vom Primärantikörper lokalisierten Antigenstellen zu Präzipitat führt. Weitere Informationen zu den zu erwartenden Farbreaktionen sind der Packungsbeilage des entsprechenden Nachweissystems zu entnehmen. Ein mit immunhistochemischen Verfahren vertrauter qualifizierter Pathologe muss vor der Interpretation der Ergebnisse die positiven und negativen Gewebekontrollen evaluieren. Positive Gewebekontrolle Die gefärbte positive Gewebekontrolle muss zuerst untersucht werden, um zu gewährleisten, dass alle Reagenzien ordnungsgemäß funktionieren. Ein ordnungsgemäß gefärbtes Reaktionsprodukt in den Zielzellen ist Anzeichen für eine positive Reaktionsfähigkeit. Weitere Informationen zu den zu erwartenden Farbreaktionen sind der Packungsbeilage des Nachweissystems zu entnehmen. In Abhängigkeit von der Inkubationszeit und der Wirkungsstärke des verwendeten Hämatoxylins führt die Gegenfärbung zu einer hell- bis dunkelblauen Färbung der Zellkerne. Übermäßige oder unvollständige Gegenfärbung kann die korrekte Interpretation der Ergebnisse beeinträchtigen. Wenn mit der positiven Gewebekontrolle keine angemessene positive Färbung nachgewiesen werden kann, müssen die Ergebnisse mit den Testpräparaten als ungültig bewertet werden. Negative Gewebekontrolle Die negative Gewebekontrolle wird nach der positiven Gewebekontrolle untersucht, um zu überprüfen, ob die spezifische Anfärbung des Zielantigens mit dem Primärantikörper korrekt erfolgt ist. Nicht vorhandene spezifische Färbung in der negativen Gewebekontrolle bestätigt die fehlende unspezifische Kreuzreaktivität mit Zellen oder Zellkomponenten. Bei spezifischer Färbung der negativen Gewebekontrolle müssen die mit den Patientenproben erzielten Ergebnisse als ungültig bewertet werden. Bei Auftreten von unspezifischer Färbung ist das Erscheinungsbild diffus. In Gewebeschnitten, die nicht optimal fixiert wurden, kann es auch zum sporadischen Auftreten von leichter Färbung von Bindegewebe kommen. Zur Interpretation der Färbeergebnisse sollten intakte Zellen verwendet werden. Nekrotische oder degenerierte Zellen weisen eine unspezifische Färbung auf. Patientengewebe Die Untersuchung der Patientenproben erfolgt zum Schluss. Die Intensität der positiven Färbung muss unter Berücksichtigung der Hintergrundfärbungen der negativen Reagenzkontrolle bewertet werden. Wie bei jedem immunhistochemischen Test bedeutet ein negatives Ergebnis lediglich, dass das fragliche Antigen nicht nachgewiesen wurde, nicht jedoch, dass das Antigen in den untersuchten Zellen/Geweben nicht vorhanden ist. Eventuell kann zur Unterstützung bei der Identifikation von falsch-negativen Reaktionen ein Antikörper-Panel verwendet werden (siehe Abschnitt Zusammenfassung der erwarteten Ergebnisse ). Bei der Interpretation aller immunhistochemischen Ergebnisse sollte die Morphologie aller Gewebeproben zusätzlich auch mit Hilfe eines mit Hämatoxylin und Eosin gefärbten Schnittes untersucht werden. Die morphologischen Befunde der Patientenproben und die dazugehörigen klinischen Daten müssen von einem qualifizierten Pathologen interpretiert werden. EINSCHRÄNKUNGEN 1. Dieses Reagenz ist nur für den Gebrauch durch Fachpersonal bestimmt, denn Immunhistochemie (IHC) ist ein aus mehreren Schritten bestehendes Verfahren, das eine besondere Schulung erfordert hinsichtlich der Wahl der geeigneten Reagenzien und Gewebe sowie bezüglich Fixierung, Aufbereitung und Präparierung der IHC-Objektträger und der Interpretation der Färbeergebnisse. 2. Nur für den Gebrauch im Labor 3. Zur In-vitro-Diagnostik 4. Die Färbeergebnisse eines Gewebes sind von sachgemäßer Behandlung und Aufbereitung des Gewebes vor dem Färben abhängig. Unsachgemäßes Fixieren, Einfrieren, Auftauen, Waschen, Trocknen, Erhitzen, Schneiden oder Kontamination mit anderen Geweben oder Flüssigkeiten kann zu Artefakten, zum Einschluss von Antikörpern oder zu falsch-negativen Ergebnissen führen. Inkonsistente Ergebnisse können die Folge von Abweichungen bei Fixierungs- und Einbettungsmethoden sowie von dem Gewebe inhärenten Unregelmäßigkeiten sein. 5. Übermäßige oder unvollständige Gegenfärbung kann die korrekte Interpretation der Ergebnisse beeinträchtigen. 6. Die klinische Interpretation jeglicher positiver Gewebefärbung oder deren Fehlen muss anhand der Krankengeschichte, Morphologie, sonstiger histopathologischer Kriterien sowie sonstiger Diagnoseverfahren erfolgen. Dieser Antikörper ist für den Gebrauch in einem Antikörper-Panel, falls zutreffend, bestimmt. Es liegt in der Verantwortung eines qualifizierten Pathologen, mit dem Färbeverfahren und der Vorbereitung der Objektträger (einschließlich Antikörper, Reagenzien und Diagnose-Panels) vertraut zu sein. Die Färbung muss in einem zertifizierten und lizenzierten Labor unter Aufsicht eines Pathologen vorgenommen werden, der für die Überprüfung der gefärbten Objektträger sowie die Gewährleistung der adäquaten positiven und negativen Kontrollen verantwortlich ist. 7. Cell Marque Antikörper und Reagenzien werden in der optimalen Konzentration zur Verwendung entsprechend der Gebrauchsanweisung geliefert. Abweichungen von den empfohlenen Testverfahren können die erwarteten Ergebnisse ungültig machen. Es müssen entsprechende Kontrollen durchgeführt und protokolliert werden. Die Benutzer tragen unter allen Umständen unbedingt die Verantwortung für die Interpretation der Patientenergebnisse. 8. Cell Marque bietet Primärantikörper in konzentrierter Form an, damit der Benutzer diese später entsprechend seiner Entscheidung für die geeigneten Validierungstechniken und deren Einhaltung optimal für den jeweiligen Gebrauch verdünnen kann. Die Verwendung von anderen als den hier empfohlenen Verdünnungsmitteln muss von den Benutzern validiert werden. Nach erfolgter Validierung des Primärantikörpers kann jede Phosphohistone H3 (PHH3) (Polyclonal) S. 4

5 Abweichung von den empfohlenen Testverfahren die erwarteten Ergebnisse ungültig machen. Es müssen entsprechende Kontrollen durchgeführt und protokolliert werden. Die Benutzer tragen unter allen Umständen unbedingt die Verantwortung für die Interpretation der Patientenergebnisse. 9. Dieses Produkt ist nicht für die Verwendung bei der Durchflusszytometrie bestimmt. 10. Bei Geweben, die im Vorfeld nicht getestet wurden, können unerwartete Reaktionen mit den verwendeten Reagenzien auftreten. Aufgrund der biologischen Schwankungen bei Antigenexpression in Neoplasmen oder anderen pathologischen Geweben können unerwartete Reaktionen auch bei getesteten Gewebegruppen nicht vollkommen ausgeschlossen werden. Setzen Sie sich bei dokumentierten unerwarteten Reaktionen mit dem Kundendienst von Cell Marque in Verbindung. 11. Gewebeproben von Personen mit Hepatitis-B-Infektion und mit dem Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg) können mit Meerrettich-Peroxidase zu unspezifischer Färbung führen. 12. Bei der Verwendung von normalen Seren aus derselben Tierquelle wie die sekundären Antiseren können in Blockierschritten durch die Wirkung von Auto-Antikörpern oder natürlichen Antikörpern falsch-negative oder falsch-positive Ergebnisse verursacht werden. 13. Falsch-positive Ergebnisse können durch nicht-immunologische Bindung von Proteinen oder Substratreaktionsprodukten entstehen. Je nach Art der verwendeten Immunfärbung können sie ebenfalls verursacht werden durch Pseudoperoxidase-Aktivität (Erythrozyten), endogene Peroxidase-Aktivität (Cytochrom C) oder endogenes Biotin (z. B. Leber, Hirn, Brust, Niere) abhängig vom verwendeten Typ der Immunfärbetechnik. 14. Wie bei jedem immunhistochemischen Test bedeutet ein negatives Ergebnis lediglich, dass das fragliche Antigen nicht nachgewiesen wurde, nicht jedoch, dass das Antigen in den untersuchten Zellen/ Geweben nicht vorhanden ist. Spezifische Einschränkungen 1. Die vorverdünnten Antikörperprodukte sind als gebrauchsfertige Produkte optimiert. Aufgrund möglicher Unterschiede bei der Gewebefixierung und -aufbereitung ist es ggf. erforderlich, die Inkubationszeit der Primärantikörper bei einzelnen Proben zu erhöhen oder zu senken. 2. Der Antikörper in Kombination mit Nachweissystemen und Zubehör erkennt Antigene, die die routinemäßige Formalin-Fixierung, Gewebepräparierung und das Schneiden überleben. Benutzer, die von den empfohlenen Testverfahren abweichen, haften, wie das unter allen anderen Umständen auch der Fall wäre, selbst für die Interpretation und Validierung der Patientenergebnisse. Zusammenfassung der erwarteten Ergebnisse Siehe folgende Reaktionstabellen: Normale Studie Gewebe Hirn 0 1 Nebennierenkortex 0 1 Eierstöcke 0 1 Pankreas 0 1 Nebenschilddrüse 0 1 Hypophyse 0 1 Schilddrüse 0 1 Brust 0 1 Milz 0 1 Mandeln Thymus 1 1 Knochenmark 0 1 Lunge 0 1 Herz 0 1 Speiseröhre 0 1 Magen 1 1 Dickdarm 0 1 Leber 0 1 Niere 0 1 Blase 0 1 Prostata 0 1 Hoden 1 1 Gebärmutter 1 1 Zervix 0 1 Skelettmuskelzellen 0 1 Glattmuskelzellen 0 1 Haut 0 1 Fettgewebe 0 1 Plazenta 1 1 Krankheitsgewebestudie Gewebe Meningeom 3 4 Gliom 4 4 Melanom 8 8 Brustkrebs 3 5 GIST (gastrointestinaler Stromatumor) 1 2 Anzahl gefärbt Gesamtzahl Anmerkungen Anzahl gefärbt Gesamtzahl Anmerkungen Phosphohistone H3 (PHH3) (Polyclonal) S. 5

6 FEHLERBEHEBUNG 1. Wenn bei der Positivkontrolle eine zu schwache Färbung auftritt, müssen andere Positivkontrollen desselben Färbedurchlaufs überprüft werden, um festzustellen, ob es an dem Primärantikörper oder an einem der üblichen Sekundärreagenzien liegt. 2. Falls die Positivkontrolle negativ ist, sollten andere Positivkontrollen aus demselben Durchlauf geprüft werden, um festzustellen, ob die Ursache im Zusammenhang mit dem Primärantikörper oder einem der üblichen Sekundärreagenzien steht. Gewebe können unsachgemäß gewonnen, fixiert oder entparaffiniert worden sein. Entnahme, Lagerung und Fixierung der Gewebeproben müssen sachgemäß ausgeführt werden. HAFTUNGSAUSSCHLUSS EMERGO EUROPE Molenstraat 15, 2513 BH, The Hague, NL. 3. Zu starke Hintergrundfärbung kann durch zu hohe Konzentrationen von endogenem Biotin verursacht werden. Es sollte ein Verfahren zur Blockierung von Biotin durchgeführt werden, es sei denn, dass ein Biotinfreies Nachweissystem verwendet wird. In diesem Fall würde jegliches vorhandenes Biotin nicht zu einer Hintergrundfärbung beitragen. 4. Wenn das Paraffin nicht vollständig entfernt wurde, muss das Entparaffinierungsverfahren wiederholt werden. 5. Wenn die Gewebeschnitte vom Objektträger abfließen, Objektträger prüfen, um zu gewährleisten, dass sie positiv geladen sind. Weitere Möglichkeiten, die sich negativ auf die Gewebeanhaftung auswirken könnten sind unzureichendes Trocken des Gewebeschnittes auf dem Objektträger vor dem Färben oder eine Formalin-Fixierung, die nicht ordnungsgemäß neutral-gepuffert wurde. Auch die Dicke der Gewebeschnitte könnte dazu beitragen. Hinweise zur Fehlerbehebung sind im Abschnitt Verfahrensschritte zu finden. Sie können sich aber auch mit dem Kundendienst von Cell Marque in Verbindung setzen. LITERATUR 1. Gurley, LR et al. Histone phosphorylation and chromatin structure during mitosis in Chinese hamster cells. Eur J Biochem 1978; 84: Hendzel, MJ et al. Chromatin condensation is not associated with apoptosis. J Biol Chem 1998; 273: Colman, H et al. Assessment and prognostic significance of mitotic index using the mitosis marker phospho-histone H3 in low and intermediate-grade infiltrating astrocytomas. Am J Surg Pathol 2006; 30: Nasr, MR & El-Zammar, O. Comparison of phh3, Ki-67, and survivin immunoreactivity in benign and malignant melanocytic lesions. Am J Dermatopathol 2008; 30: Kim, YJ et al. Prognostic significance of the mitotic index using the mitosis marker anti-phosphohistone H3 in meningiomas. Am J Clin Pathol 2007; 128: Phosphohistone H3 (PHH3) (Polyclonal) S. 6