Antibiotikarückstandskontrolle im Rahmen des nationalen Rückstandskontrollplans (NRKP) Detlef Bohm
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- Detlef Brinkerhoff
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1 Antibiotikarückstandskontrolle im Rahmen des nationalen Rückstandskontrollplans (NRKP) Detlef Bohm
2 Überwachung durch BVL Nationaler Plan des BVL im Bereich Lebensmittel Nationaler Rückstandskontrollplan für Lebensmittel tierischen Ursprungs (NRKP) Untersuchung auf unerwünschte Stoffe bzw. auf Überschreitung von Höchstmengen erlaubter Substanzen seit 1989 durchgeführt einheitliche Maßstäbe in der EU in Deutschland vom BVL koordiniert Bundesländer untersuchen die Proben und melden Ergebnisse an das BVL BVL-Symposium, Berlin, Nov Seite 2
3 Basis-Dokumente für NRKP Grundlegende EU-Regularien für die Rückstandskontrolle von Tierarzneimitteln in Lebensmitteln tierischer Herkunft Richtlinie (EG) Nr. 96/23 von 1996 über Kontrollmaßnahmen hinsichtlich bestimmter Stoffe und ihrer Rückstände in lebenden Tieren und tierischen Erzeugnissen Entscheidung (EG) Nr. 97/747 von 1997 über Umfang und Häufigkeit der in der Richtlinie 96/23/EG des Rates vorgesehenen Probenahmen zum Zweck der Untersuchung in bezug auf bestimmte Stoffe und ihre Rückstände in bestimmten tierischen Erzeugnissen (Milch, Eier, Honig, Wild, Kaninchen) Verordnungen (EG) Nr. 470/2009 und (EG) Nr. 37/2010 für die Festsetzung von Höchstmengen für Rückstände pharmakologisch wirksamer Stoffe in Lebensmitteln tierischen Ursprungs BVL-Symposium, Berlin, Nov Seite 3
4 Anwendungsbereich des NRKP Tierarten und Primärerzeugnisse tierischen Ursprungs in Richtlinie 96/23/EG Rind, Schaf, Ziege, Schwein und Pferd Geflügel Aquakulturen Milch Eier Substanzgruppen Antibiotika Kaninchen, Wild und Zuchtwild Honig Basis für Nationalen Rückstandskontrollplan (NRKP) Untersuchung von ca Proben in 2013 BVL-Symposium, Berlin, Nov Seite 4
5 Matrizes aus 96/23/EG für NRKP Relevante Matrizes zur Rückstandskontrolle auf Antibiotika - Rind, Schwein, Schaf, Ziege, Pferd - Kaninchen - Wild - Geflügel Leber Muskel Niere Futtermittel Tränkewasser Leber Muskel Niere - Aquaprodukte - Milch - Eier - Honig Leber Muskel Muskel + Haut BVL-Symposium, Berlin, Nov Seite 5
6 Gruppe A - Stoffe mit anaboler Wirkung und nicht zugelassene Stoffe A1-A6: Zielsubstanzen aus 96/23/EG für NRKP Stilbene, Thyreostatika, Steroide, Resorcylsäure-Lactone, ß-Agonisten, Chloramphenicol, Nitrofurane, Nitroimidazole, Dapson Gruppe B - Tierarzneimittel und Kontaminanten B1: Stoffe mit antibakterieller Wirkung (einschließlich Sulfonamide and Chinolone) B2: Sonstige Tierarzneimittel (a) Anthelmintika (b) Kokzidiostatika (c) Carbamate und Pyrethroide (d) Sedativa (e) nicht-steroidale Entzündungshemmer (NSAIDs) (f) sonstige Stoffe mit pharmakologischer Wirkung B3: Andere Stoffe und Umweltkontaminanten (a) organische Chlorverbindungen, einschließlich PCBs (b) organische Phosphorverbindungen (d) chemische Elemente (d) Mykotoxine (e) Farbstoffe (f ) Sonstige BVL-Symposium, Berlin, Nov Seite 6
7 Substanzen mit antibakterieller Wirkung Antibiotika der Gruppe B1 aus 96/23/EG für den NRKP Aminoglykoside Amphenicole Sulfonamide Diamino-Pyrimidin-Derivate Tetracycline Penicilline Chinolone Lincosamide Makrolide Cephalosporine Pleuromutiline Polypeptide Ansamycine Sonstige (Avilamycin) BVL-Symposium, Berlin, Nov Seite 7
8 Einsatz von Antibiotika Abgegebene Antibiotika je Wirkstoffklasse in der Veterinärmedizin (Auszug aus der Liste von 2014 für Deutschland) Wirkstoffklasse Penicilline 450 Tetracycline 342 Sulfonamide 121 Makrolide 109 Polypeptid-Antibiotika 107 Aminoglykoside 38 Lincosamide 15 Pleuromutiline 13 Fluorchinolone 12,3 Abgegebene Menge in t BVL-Symposium, Berlin, Nov Seite 8
9 Analyse auf Antibiotika-Rückstände Ablauf einer Analyse auf Rückstände NRKP 2013: ca Proben auf Antibiotika untersucht und 15 non-compliant = 0.09 % BVL-Symposium, Berlin, Nov Seite 9
10 Methoden zur Rückstandskontrolle Screening-Methoden und Bestätigungs-Methoden Screening - einfache Methode zum Nachweis möglichst vieler Antibiotika - Detektion der Substanzen unter dem Level of interest (z. B. MRL*) - Erfassung alle positiven Befunde (Sensitivität) - Vermeidung falsch positiver Ergebnisse (Spezifität) - große Probenzahl bei geringen Kosten und wenig Zeitaufwand untersuchen - z. B. Dreiplattentest für Hemmstoffe (ca Proben in 2013), Immunologische Methoden (z. B. ELISA, Biosensor), LC-TOF, LC-MS/MS Bestätigung - vollständige Daten zur eindeutigen Identifizierung eines Antibiotikums - notwendige Identifizierungspunkte - Quantifizierung im interessierenden Konzentrationsbereich (z. B. MRL*) - z. B. LC-MS/MS, LC-DAD, LC-FLD Beide Methodenarten müssen Kriterien der Entscheidung 2002/657/EG erfüllen! *) Maximum Residue Limit = Rückstandshöchstmenge (EU-Verordnung 37/2010) BVL-Symposium, Berlin, Nov Seite 10
11 Grundlage für Analytik von Antibiotika Entscheidung 2002/657/EG der EU-Kommission vom 14. August 2002 zur Umsetzung der Richtlinie 96/23/EG des Rates betreffend die Durchführung von Analysemethoden und die Auswertung von Ergebnissen - Definition von Begriffen - Leistungskriterien und Anforderungen für Methoden - Validierungsverfahren von Methoden 2002/657/EG nur für Lebensmittel tierischen Ursprungs bezieht sich nicht auf: Pflanzliche Produkte Verarbeitete Produkte Futtermittel Hygienische Kontrollen BVL-Symposium, Berlin, Nov Seite 11
12 Validierung nach 2002/657/EG Ansätze zur Validierung Laborvergleichsuntersuchung konventionellen oder klassischen Ansatz alternativen Ansatz zur Validierung (In-house-Konzept) gestattet die simultane Validierung von: - verschiedenen Tierarten - verschiedenen Matrizes - und anderen Faktoren für die Robustheit BVL-Symposium, Berlin, Nov Seite 12
13 Validierung von Methoden im NRL Validierung nach In-house-Konzept mit InterVal * Matrix und Tierarten übergreifendes Konzept Auswahl von Faktoren mit praxisnahen Hintergrund im Labor Variation dieser Faktoren auf 2 Niveaus mindestens 4 Konzentrationen zur Dotierung der Matrizes (einschließlich 0,5-, 1,0- und 1,5-fache des zulässigen Grenzwertes) Erstellung eines Versuchsplanes mit statistischer Variation Berechnung der Parameter für die Validierung *) InterVal = Software von QuoData Dresden BVL-Symposium, Berlin, Nov Seite 13
14 Versuchsplan für Validierung Multimethode für Niere von Schwein und Rind Run Tierart Operator LC-Säule Lot von SPE Zeitpunkt der Messung nach Aufarbeitung Lagerbedingung der Probe im KS Run 01 Schwein L neu B nach 12 h 2 Tage Run 02 Schwein L alt B direkt 1 Tag Run 03 Schwein M neu A nach 12 h 1 Tag Run 04 Schwein M alt A direkt 2 Tage Run 05 Rind L neu A direkt 2 Tage Run 06 Rind L alt A nach 12 h 1 Tag Run 07 Rind M neu B direkt 1 Tag Run 08 Rind M alt B nach 12 h 2 Tage 8 Runs mit je 5 Konzentrationen = 40 Analysenproben Aufwand für klassischen Validierungsansatz (3 Konzentrationen) = 108 Proben Konzept der Faktor-Level-Kombinationen auch geeignet für Ringversuche ( 64 LFGB)! BVL-Symposium, Berlin, Nov Seite 14
15 Ergebnis der Validierung Recovery-Kurven von 8 Runs für Tylosin in Niere µg/kg 2 0 0, , ,0 0 0 Measurement Values 1 4 0, , , , , ,0 0 0 MRL 2 0, C o n c e n tra tio n µg/kg R u n 0 1 R u n 0 2 R u n 0 3 R u n 0 4 R u n 0 5 R u n 0 6 R u n 0 7 R u n 0 8 Konzentrationen: 0,25/0,5/1,0/1,5/2,0 x MRL BVL-Symposium, Berlin, Nov Seite 15
16 Validierungsparameter Validierung für Niere von Schwein und Rind Substanz max. CC-alpha CC-beta RSDr RSDwR Recovery CC-alpha [µg/kg] [µg/kg] [µg/kg] [%] [%] [%] Oxytetracyclin ,2 7,4 98 Enrofloxacin ,5 5,0 118 Tylosin ,9 7,9 98 Lincomycin ,4 9,2 103 Trimethoprim ,3 6,8 103 Ampicillin 73, ,3 8,3 101 Cefalexin ,1 6,4 101 Valnemulin ,6 10,7 108 Sulfadiazin ,6 8,7 105 Virginiamycin ohne 7,9 9,8 9,3 9,3 101 *) RSD r = relative Wiederholbarkeit **) RSD wr = relative laborinterne Reproduzierbarkeit BVL-Symposium, Berlin, Nov Seite 16
17 LC-MS/MS-Methoden im NRL Multi-Methoden für Bestätigung mehrerer Antibiotika-Gruppen für Tetracycline, Chinolone, Pleuromutiline, Macrolide, Lincosamide, Sulfonamide, Penicilline, Cephalosporine, Diamino-Pyrimidin-Derivate sowie Dapson, Virginiamycin, Rifaximin and Bacitracin (ca Substanzen) in Milch in Honig in Gewebe von Rind, Schwein, Geflügel und Aquakulturen Methoden für Bestätigung mehrerer Substanzen einer Gruppe für Aminoglykoside in Gewebe von Rind und Schwein sowie in Milch für Quinoxaline in Gewebe vom Schwein BVL-Symposium, Berlin, Nov Seite 17
18 Anforderungen an Bestätigungsmethode Kriterien der Entscheidung 2002/657/EG (betreffend die Validierung und Durchführung von Analysenmethoden) Retentionszeit muss Kalibrierstandard entsprechen Relative Ionen-Intensität (Verhältnis der gemessenen Massenfragment-Ionen) muss Kalibrierstandard entsprechen Flüssigchromatographie (LC) mit MS-Detektion LC-MS/MS (MRM-Mode) 1 Precursor, 2 Fragmente 4 Identifizierungspkt. Bestätigung von Antibiotika BVL-Symposium, Berlin, Nov Seite 18
19 MS/MS-Darstellung Multiple Reaction Monitoring (MRM) mit Triple-Quadrupol-MS Ionen-Quelle Q1 Q2 (Kollisionszelle) Q3 Detektion Kollisionsenergie Precursor-Ion Fragment-Ion Gamithromycin (Makrolid) (158) Precursor-Ion = 1,0 Ident.pkt. Fragment-Ion = 1,5 Ident.pkt. BVL-Symposium, Berlin, Nov Seite 19
20 LC MS/MS LC-MS/MS-System Kopplung Flüssigchromatograph (LC) mit Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (MS/MS) Ionen-Quelle BVL-Symposium, Berlin, Nov Seite 20
21 LC-MS/MS-Chromatogramm MRM-Darstellung von Penicillinen in Milch TIC von Penicillinen in Milch 2 MRM-Übergänge 20 µg/kg Pen V MRM Quantifier MRM Qualifier Retentionszeit BVL-Symposium, Berlin, Nov Seite 21
22 Zusammenfassung Rückstandskontrolle von Lebensmitteln tierischer Herkunft durch NRKP auf Basis der EU-Richtlinie 96/23/EG auf Antibiotika werden etwa ein Drittel der NRKP-Proben und weitere ca Proben durch den Dreiplattentest untersucht Einsatz von Screening- und Bestätigungsmethoden für die Analytik auf Grundlage der EU-Entscheidung 2002/657/EG Identifizierung und Quantifizierung der Rückstände von pharmakologisch wirksamen Substanzen durch LC-MS/MS-Technik BVL-Symposium, Berlin, Nov Seite 22
23 Vielen Dank an Frau Sabine Mönch für die analytischen Arbeiten und an Frau Dr. Ina More für die Informationen zum NRKP BVL-Symposium, Berlin, Nov Seite 23
24 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit! Kontakt: BVL-Symposium, Berlin, Nov Seite 24
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