Untersuchungen zur Platin-DNA-Adduktbildung mittels Kapillarelektrophorese
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- Oskar Thomas
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1 Berichte aus der Pharmazie Ulrich Warnke Untersuchungen zur Platin-DNA-Adduktbildung mittels Kapillarelektrophorese Möglichkeiten und Grenzen D 188 (Diss. Freie Universität Berlin) Shaker Verlag Aachen 2001
2 INHALT 1 Einleitung _ Kapillarelektrophorese Aufbau eines CE-Systems Prinzipien der Kapillarelektrophorese Elektrophorese Elektroendosmotischer Fluss Effizienz und Peakaufiösung Therapie maligner Tumoren mit Platinkomplexen ' Maligne Tumoren Platinkomplexe in der Onkologie Analytik von Platin-DNA-Addukten Surrogatfunktion Platin-DNA-Adduktbildung Besondere Strategien für die Therapie mit Platinkomplexen Problemstellung und Zielsetzung 27 2 Material und Methoden Materialien Chemikalien und Reagenzien Verwendete Lösungen und Puffer Verbrauchsmaterialien Geräte Kapillarelektrophorese Entwicklung eines CZE-Trennsystems Messprinzip Trennsystem und Detektion Methodenentwicklung und-optimierung Validierung Spezifität Messbereich, Linearität Stabilität 43
3 Bestimmungs- und Nachweisgrenze Richtigkeit und Präzision Qualitäts-Kontroll-Proben (Qualtty Control Samples) AA Kalibrierung Konzentrationsberechnung Untersuchungen zur Adduktbildung mit Mononukleotiden CZE-Untersuchungen mit Standardnukleotiden Inkubationen mit Cisplatin, Carboplatin, Oxaliplatin und Lobaplatin CE/MS-Kopplung Aufklärung der Adduktidentität Spezielle Untersuchung der 6-O-N(7)-Chelatbildung ' Untersuchungen zur Adduktbildung mit DNA Untersuchungen mit Kalbsthymus-DNA Isolierung der Leukozyten Untersuchungen mit Leukozyten und Tumorzellen Inkubation von Leukozyten mit Cisplatin Inkubation von Tumorzell-ünien mit Cisplatin DNA-Isolierung aus Leukozyten und Tumorzellen Bestimmung des DNA-Gehaltes Enzymatischer Abbau isolierter DNA CE mit verdauter DNA Quantifizierung der Platin-DNA-Adduktbildung mittels ELISA Untersuchungen mit Platin-Albumin-Konjugaten 59 3 Ergebnisse Entwicklung und Optimierung einer CZE-Bestimmungsmethode Experimentelle Bestimmung der Mobilität von Desoxymononukleotiden Berechnung der Nettoladung Berechnung des Quotienten aus Nettoladung und Masse Korrelation der Modellvorhersagen mit den experimentell bestimmten Mobilitätswerten Einfluss der Konzentration des Trennelektrolyten Einfluss von Trennspannung und Temperatur Zusammenfassung 73
4 3.2 Vorstudienvalidierung Spezifität Messbereich und Linearität Stabilität ~ Bestimmungs- und Nachweisgrenze Richtigkeit und Präzision CZE-Untersuchungen zur Adduktbildung von Platinkomplexen Inkubation von Nukleotiden mit Cisplatin Elektropherogramme Abnahmekinetik der Mononukleotide Konzentrationsabhängigkeit der Adduktbildung Charakterisierung der Adduktmuster Einfluss der Chloridionen-Konzentration Bestimmung der Absorptionsquotienten A 2M /A 2 6o Untersuchung der Adduktbildung mittels Dioden-Array-Detektion (DAD) Inkubation von Nukleotiden mit Carboplatin Inkubation von Nukleotiden mit Oxaliplatin und Lobaplatin Identifizierung der Platin-Nukleotid-Addukte mittels CZE/ESI-MS-Kopplung Cisplatin-Addukte O-N(7)-Chelatbildung Addukte weiterer Platinkomplexe Carboplatin Oxaliplatin und Lobaplatin Untersuchungen zur Adduktbildungskinetik Kinetische Untersuchungen der Cisplatin-Adduktbildung mit dgmp Kinetische Untersuchungen der Cisplatin-Adduktbildung mit damp Untersuchungen zur Adduktbildung mit DNA CZE-Untersuchungen zur Platin-DNA-Adduktbildung mit Kalbsthymus-DNA Quantifizierung der Platin-DNA-Adduktbildung in Tumorzellen mittels ELISA Quantifizierung der Platin-DNA-Adduktbildung in Leukozyten mittels ELISA CZE-Untersuchungen der Platin-DNA-Adduktbildung in Tumorzellen CZE-Untersuchungen der Platin-DNA-Adduktbildung in Leukozyten Anwendung der CZE-Methode zur Untersuchung der Adduktbildung von Platin- Albumin-Konjugaten 115
5 3.7.1 Reaktivität der Platin-Konjugate A-Plat IX und A-Plat X Inkubationen in neutralem ph-milieu Inkubationen in saurer Umgebung Inkubationen in neutralem ph-milieu nach vorangegangener saurer Spaltung Untersuchung der Bindung an Albumin Reaktivität aktiver Teilstrukturen von (potenziellen) Platin-Konjugaten Diskussion Kapillarzonenelektrophorese Bestimmungsmethode Adduktbildung verschiedener Platinkomplexe Änderungen der UV-Absorption durch die Bildung von Addukten Adduktidentifizierung mittels CZE/ESI-MS-Kopplung Quantifizierung der zellulären Platin-DNA-Adduktbildung Anwendung der CZE-Methode im Rahmen von Screening-Untersuchungen mit Platin-Albumin-Konjugaten 137 : Perspektiven Zusammenfassung Literatur 149
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