Untersuchung der differentiellen Genexpression mit DNA-Microarrays bei Akuter Lymphoblastischer Leukämie im Vergleich mit normalen B-Lymphozyten
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1 Untersuchung der differentiellen Genexpression mit DNA-Microarrays bei Akuter Lymphoblastischer Leukämie im Vergleich mit normalen B-Lymphozyten Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät (mathematisch-naturwissenschaftlicher Bereich) der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg von Herrn Dipl.-Biol. Uwe Eduard Hattenhorst geboren am in Wuppertal Gutachter: 1. Prof. Dr. rer. nat. Gunter Reuter 2. Prof. Dr. med. Stefan Burdach 3. Prof. Dr. rer. nat. Friedemann Horn Halle (Saale), 20. Oktober 2003, Tag der Verteidigung urn:nbn:de:gbv: [
2 La vraie générosité envers l avenir consiste à tout donner au présent. Albert Camus
3 1 Einleitung Die akute lymphoblastische Leukämie Leukämogenese, die Entstehung von Leukämien Hämatopoese, die Entstehung der zellulären Bestandteile des Blutes Funktionelle Genomik Differentielle Genexpression und funktionelle Genomik der call 15 2 Material und Methoden Chemikalien und Enzyme Untersuchungsmaterial Übersicht über die verwendeten Proben Patientencharakteristika Aufarbeitung des Untersuchungsmaterials Isolation von Lymphozyten über Dichtegradientenzentrifugation Gewebedisaggregation und Herstellung von Einzelzellsuspensionen Kryokonservierung humaner Zellen Zellzahlbestimmung Separation von B-Lymphozyten Durchflusszytometrische Untersuchung des Probenmaterials Präparation der Nukleinsäuren für die Analyse der Genexpression Präparation von Gesamt-RNA mittels Phenol-Chloroform-Extraktion Aufreinigung der präparierten RNA Optionale Ethanol-Präzipitation von RNA Erst-Strang cdna-synthese Zweit-Strang-Synthese Phenol-Chloroform-Extraktion der DNA in vitro-transkription Aufreinigung der IVT-Produkte Fragmentierung der cdna Qualitätskontrolle der präparierten Nukleinsäuren Native Gelelektrophorese Photometrische Konzentrationsbestimmung Affymetrix Gene Chip Instrument System High-density Oligonucleotide Arrays Eigenschaften der verwendeten Arrays Hybridisierung Waschen und Färben der Microarrays Microarray Scan 32 I
4 Waschen und Färben mit Antikörperverstärkung Microrray Scan nach Antikörperverstärkung Computer-gestützte Analyse der Genexpression Normalisierung Normalisierung der EOS-H Genechips Lineare Regression der EOS-H Genechips Normalisierung der Affymetrix HG-U133A Genechips Methoden zur Auswertung der Genexpressionsdaten Identifikation differentiell exprimierter Transkripte Idendifikation von Klassen und Clustern 39 3 Ergebnisse Eigenschaften der verwendeten Proben Die Leukämieproben Die Kontrollproben Qualitätskontrolle der Genechips und Ausschluss von Proben EOS-H Genechip HG-U133A Genechip Expressionsprofile typischer differenzierungsrelevanter Marker Identifikation differentiell exprimierter Gene EOS-H Genechip HG-U133A Genechip Klassifikation der Proben mit differentiell exprimierten Markergenen Genexpressionsprofile ermittelt mit unterschiedlichen Genechips Gegenüberstellung der Ergebnisse von EOS-H und HG-U133A Analyse der auf beiden Genechips untersuchten Proben Funktionelle Gruppen differentiell exprimierter Gene Clustern der differentiell exprimierten Gene Einteilung der Gene in funktionelle Gruppen Entwicklung von B-Lymphozyten Immunsystem und Inflammation Replikation von DNA, Transkription, Proteinsynthese Signaltransduktion und Regulation von Genexpression Regulation von Differenzierung und Entwicklung Regulation von Zellzyklus und Zellproliferation Allgemeiner Metabolismus Gene mit bekannten Zusammenhängen zu Krebserkrankungen Gene, die sich keiner der Gruppen zuordnen lassen Gene, die mit beiden Chiptypen detektiert wurden 91 II
5 3.7 Untergruppen der Leukämien call mit t(12;21)(p13;q22) TEL/AML1-Translokation Identifikation differentiell exprimierter Gene Klassifikation der Proben mit differentiell exprimierten Genen Differentiell exprimierte Gene der TEL/AML1-cALL Unterschiede der Leukämien mit und ohne TEL/AML1-Translokation Diskussion Leukämische Blasten der call und gesunde B-Lymphozyten EOS-H und HG-U133A. Zwei unterschiedliche Genechiptypen Genexpressionsprofil der call im Kindesalter call mit TEL/AML1-Translokation Vergleich der Ergebnisse mit anderen Genexpressionsstudien Gene mit besonderem Einfluss auf die Pathologie der call Leukämische Blasten sind Zellen mit hoher Proliferationsrate Überleben und programmierter Zelltod leukämischer Zellen Die call ist eine Erkrankung von B-Vorläuferzellen TGFβ/BMP und WNT, kooperative Signalwege leukämischer Zellen Proliferation oder Differenzierung? Zusammenfassung Anhang Tabellen Abkürzungsverzeichnis Anmerkungen zur verwendeten Nomenklatur Literaturverzeichnis Publikationsliste 184 III
3 Ergebnisse. Ergebnisse. 3.1 Eigenschaften der verwendeten Proben. 3.1.1 Die Leukämieproben
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