Rekombinante Antikorper. fur,,lab-on-chip"
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- Helmut Langenberg
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1 Rekombinante Antikorper fur,,lab-on-chip" Von der Fakultat fur Lebenswissenschaften der Technischen Universitat Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Dissertation von aus Laila Al-Halabi Bramsche
2 1. Einleitung Antikorper und rekombinante Antikorper-Fragmente Phagen Display C-reaktives Protein (CRP) Lab-on-chips Zielsetzung Material und Methoden Material Antikorpergen-Bibliotheken Bakterienstamme, Bakteriophagen und Zelllinien Plasmide Oligonukleotide Enzyme Antikorper Chemikalien Puffer und Losungen Nahrmedien und Supplemente Kit-Systeme Verbrauchsmaterialien Laborgerate und Zubehor Computerprogramme und Datenbanken Sonstiges Mikrobiologische Methoden Anzucht von Bakterienstammen Bestimmung der ODeoo von Bakterienkulturen Anlegen von Glycerinstocks Herstellung chemokompetenter Zellen Transformation von E. colixl-\ Blue mittels Hitzeschock Produktion von scfv Produktion von scfv in Mikrotiterplatten Molekularbiologische Methoden Preparation von K colixl-1 Blue Plasmid-DNA Preparation von K colixl-l Blue Plasmid-DNA mittels Qiagen 22 Plasmid Midi Kit (100) Kit Amplifikation von DNA via Kolonie-PCR 22
3 2.3.4 Restriktionsverdau Dephosphorylierung endstandiger 5'-DNA-Phosphatgruppen Ligation von DNA-Fragmenten Agarose-Gelelektrophorese Aufreinigung von DNA aus Losungen und Agarosegelen Quantifizierung von DNA in Losungen Prazipitation von DNA aus Losungen Sequenzierung von Plasmid-DNA und DNA-Fragmenten (modifiziert 25 nach Sanger etal, 1975) 2.4 Generierung humaner rekombinanter Antikorperfragmente HerstellungvonM13-Phagen Titerbestimmung von M13-Phagen Selektion scfv-prasentierender Phagen Proteinbiochemische Methoden Reinheitsbestimmung von CRP uber analytische Gelausschluss- 28 chromatographie Preparation von scfv aus dem Periplasma von E. colixl-l Blue Fallung von scfv aus dem Kulturiiberstand von E. colixl-\ Blue Indirekter Antigen-ELISA Human-Capture-ELISA CRP-Sandwich-ELISA SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Silberfarbung von Polyacrylamidgelen Western-Blot Immunfarbung Reinigung von scfv-fc-fusionsproteinen uber Protein A Reinigung von scfv uber Nickel-Chelat-Sepharose Bestimmung der Dissoziationskonstante K D mittels BIAcore Bestimmung der Antigenbindestelle CRP-spezifischer scfv mittels 34 BIAcore Bestimmung der Antigenbindestelle CRP-spezifischer scfv mittels 34 Peptidmembranen Entfarben von Peptidmembranen Kopplung von CRP-Peptiden an BSA Kopplung von Antikorperfragmenten an Gold uber DSP Kopplung von Antikorperfragmenten an Gold uber SAM 37
4 Kopplung von Antikorperfragmenten an Gold uber Mercaptoundecansaure Rasterkraftmikroskopie von Goldoberflachen Messung von CRP aus einer Losung mit einer Quarzkristallmikrowaage Zellbiologische Methoden Kultivierung von HEK 293 T Zellen Transfektion von HEK 293 T Zellen Ergebnisse Gelfiltration des Panning- Targets C-reaktives Protein (CRP) Selektionen von rekombinanten Antikorper-Fragmenten gegen CRP Analyse von Einzelklonen aus den Antikorper-Selektionen gegen CRP Produktion und proteinbiochemische Analyse Sequenz-Analyse Produktion CRP-spezifischer scfv-fragmente in E. coli Klonierung der scfv-genfragmente in den Vektor popelol far die 43 Expression von scfv- Proteinen in E. colixl-l Blue MRF' Expression und Aufreinigung CRP-spezifischer scfv in E. colixl-l 43 Blue MRF' 3.5 Stabilitatsanalyse CRP-spezifischer scfv Bestimmung der Dissoziationskontante (K D ) CRP-spezifischer scfv mittels 45 Oberflachenplasmonresonanz 3.7 Oberflachenplasmonresonanzanalyse CRP-spezifischer scfv mit unter- 47 schiedlichen Epitopen 3.8 Epitop-Bestimmung CRP-spezifischer scfv mit Peptidmembranen Kopplung von CRP-Peptiden an BSA Selektion von Antikorpern gegen CRP-Peptid-Epitope Analyse von Einzelklonen aus den Antikorper-Selektionen gegen CRP-Peptide 55 im ELISA Produktion und proteinbiochemische Analyse Sequenz-Analyse Kopplung unterschiedlicher Antikorperformate an Goldoberflachen Generierung CRP-spezifischer scfv mit einer C-terminalen Thiol- 58 Gruppe enerierung CRP-spezifischer scfv-fc-fusionsproteine und Produktion 59 in HEK293T Zellen 3.13 Untersuchung der Parameter fur die Kopplung unterschiedlicher 61 Antikorperformate an Gold
5 3.14 Messung von CRP in einer Losung in einem mikrofluidischen System Diskussion Humane rekombinante Antikorper gegen CRP Selektion von humanen rekombinanten Antikorperfragmenten gegen CRP- 73 Peptide 4.3 Kopplung von scfv an Goldoberflachen ,,Lab-on-chip"-Systeme fur die Serumdiagnostik von CRP Ausblick Zusammenfassung 81 Summary Iiteraturverzeichnis Anhang Vektorkarten Sequenzen der Peptidmembranen 97
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