Biofunktionalisierung von metallischen Nanopartikeln

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1 Biofunktionalisierung von metallischen Nanopartikeln zur Entwicklung von Biosensoren Zur Erlangung des akademischen Grades eines DOKTORS DER NATURWISSENSCHAFTEN (Dr. rer. nat.) Fakultät für Chemie und Biowissenschaften - Karlsruher Institut für Technologie (KIT) genehmigte DISSERTATION Universitätsbereich von M.Sc. Dania Marile Kendziora aus Gelsenkirchen Dekan: Prof. Dr. M. Bastmeyer Referent: Prof. Dr. S. Brase Korreferent: Prof. Dr. A. Ulrich Tag der mündlichen Prüfung:

2 Inhaltsverzeichnis 5 INHALTSVERZEICHNIS Kurzzusammenfassung 9 1 Einleitung Synthese und Eigenschaften von metallischen Nanopartikeln Citrat-Methode zur Synthese von Gold Nanopartikeln Synthese von Gold Nanopartikeln mit Thiol-Liganden Photochemische Synthese von Gold Nanopartikeln Polyol-Methode zur Synthese von metallischen Nanopartikeln Synthese von fluoreszenten Gold Nanopartikeln Biofunktionalisierung von metallischen Nanopartikeln Linker zur Modifikation von Gold Nanopartikeln Synthese von Gold Nanopartikel-DNA Konjugalen Synthese von Nanopartikel-Protein Konjugalen Anwendungen von metallischen Nanopartikeln Fluoreszente Nanopartikel als optische Marker und Sensoren Anwendungen von Nanopartikeln in der Oberflächen-verstärkten Raman Spektroskopie Anwendungen von Nanopartikeln in der Tumorzellenforschung Verwendung von Nanopartikeln als Biosensoren Aufgabenstellung 32 2 Ergebnisse und Diskussion Synthese von Nanopartikeln in Gegenwart von Metallothioneinen Expression und Reinigung von Metallothionein-Fusionsproteinen Photochemische Synthese von metallischen Nanopartikeln Verknüpfung von Nanopartikeln mit BAG1 -Peptiden Modifikation des trifunktionellen Linkers mit einem Fluoreszenzmarker Entfernung der Boc-Schutzgruppe des Atto610-modifizierten Linkers Modifikation von BAG 1 Peptiden durch Einführung eines Alkin 47

3 6 Inhaltsverzeichnis Modifikation eines Propargylglycin-BAG 1 -Peptids durch Kupfer-katalysierte Alkin- Azid Cycloaddition Modifikation von magnetischen Nanopartikeln mit fluoreszent-markiertem trifunktionellen Linker Synthese und Modifikation von Gold Nanopartikeln zur Anwendung in der Tumorzellenforschung Synthese von Liponsäure-stabilisierten AuNP Trifunktionelle Linkersysteme zur Modifikation von Gold Nanopartikeln Synthese von Gold Nanopartikeln mit Boc-geschützten Liponsäure-Linkern Synthese von Gold Nanopartikeln mit trifunktionellen Liponsäure-Linkern mit freien Aminen Kupfer-katalysierte Azid-Alkin Cycloaddition zur Modifikation von Alkinfunktionalisierten AuNP Modifizierung der freien Aminogruppe der AuNP-L2a-DNAl Untersuchung der Voraussetzungen für Immobilisierungsexperimente DNA-vermittelte Immobilisierung von AuNP-DNAl-Häm DNA-vermittelter Aufbau von Protein-AuNP-AgNP Konjugaten zum Nachweis in SERS-Experimenten Synthese des EYFP-DNA4 Konjugats Synthese von Citrat-stabilisierten AuNP Modifikation von Citrat-stabilisierten AuNPs mit DNA-Oligonukleotiden Test der Stabilität von DNA-modifizierten Nanopartikel Immobilisierung von EYFP-DNA4 auf DNA-modifizierten AuNP Direkte Hybridisierung von DNA-modifizierten Nanopartikeln mit einem fluoreszenten Protein Oberflächen-verstärkte Raman-Spektroskopie des EYFP-AuNP-AgNP Konstrukts Zusammenfassung und Ausblick Synthese von Nanopartikeln in Gegenwart von Metallothioneinen Verknüpfung von magnetischen Nanopartikeln mit BAG1 -Peptiden Synthese und Modifikation von Gold Nanopartikeln zur Anwendung in der Tumorzellenforschung 116

4 Inhaltsverzeichnis Trifunktionelle Linker zur Modifikation von Gold Nanopartikeln DNA-vermittelter Aufbau von Protein-AuNP-AgNP Konjugaten zum Nachweis in SERS-Experimenten Material und Methoden Chemikalien Pufferverzeichnis Verwendete Methoden und Geräte Oberflächen-verstärkte Raman Spektroskopie Transmissionselektronenmikroskopie Matrix-unterstützte Laser-Desorption Ionisation UV-Vis und Fluoreszenz-Spektroskopie Schnelle Flüssigkeitschromatographie Hochdruckflüssigkeitschromatographie Polyacrylamid Gelelektrophorese Agarose Gelelektrophorese Färbemethoden für die Gelelektrophorese Modifikation eines trifunktionellen Linkers mit Atto610-NHS Modifikation des HA-Peptids mit 3-Ethynylanillin durch Diazokupplung" Kupfer-freie Azid-Alkin Cycloaddition mit Linker für Ene-artige Reaktion"39' Synthese von Gold Nanopartikeln Citrat-Methode Synthese von AuNP in Gegenwart von Liponsäure und Liponsäure-Derivaten128' Photochemische Synthese zur Bildung von Nanopartikeln'29' Modifikation von Liponsäure-AuNP mit Octadecylamin Kupfer-katalysierte Azid-Akin Cycloaddition zur Modifikation von AuNP-L2 mit Azid-DNA"43' Kovalente Verknüpfung von Häm mit AuNP-L2a-DNA Rekonstitution von Apo-Myoglobin durch Häm-DNA-AuNPs Synthese von AuNP-Mb Synthese des Myoglobin-DNA 1 Konjugats DNA-vermittelte Immobilisierung von AuNP Beschichtung von Mikrotiterplatten mit Streptavidin Immobilisierung von DNA-AuNP 137

5 8 Inhaltsverzeichnis Bestimmung der Aktivität von Myoglobin durch AmpliFluRed DNA-vermittelter Aufbau von AuNP-AgNP-Protein Konjugaten DNA-Modifizierung von Nanopartikeln durch Ligandenaustausch Synthese von EYFP-DNA4 Konjugaten Testhybridisierung verwendeter DNA-Sequenzen Hybridisierung von AuNP-DNA2-cDNA4 mit EYFP-DNA Hybridisierung von AuNP-DNA2-cDNA4 mit AgNP-cDNA2 und EYFP-DNA Verwendete DNA-Sequenzen Expression von Metallothionein-Fusionsproteinen Amylose Affinitätschromatographie Abkürzungsverzeichnis Literatur Danksagung Lebenslauf Publikationen Konferenzbeiträge 155