Maike van Ohlen (Autor) Pieris rapae und das Glucosinolat-Myrosinase-System Cyanidentgiftung in Lepidoptera

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1 Maike van Ohlen (Autor) Pieris rapae und das Glucosinolat-Myrosinase-System Cyanidentgiftung in Lepidoptera Copyright: Cuvillier Verlag, Inhaberin Annette Jentzsch-Cuvillier, Nonnenstieg 8, Göttingen, Germany Telefon: +49 (0) , Website:

2 Inhaltsverzeichnis... I Abbildungsverzeichnis... V Tabellenverzeichnis... VIII Symbol- und Abkürzungsverzeichnis... IX 1 Einleitung Pflanzen und Herbivoren im evolutionären Wettrüsten Das Glucosinolat-Myrosinase-System der Brassicaceae als Drehscheibe für Pflanzen-Insekten-Interaktionen Die Abwehrfunktion des pflanzlichen Glucosinolat-Myrosinase-Systems Anpassung von Generalisten und Spezialisten Pieris rapae und das Nitril-spezifizierende Protein Stoffwechsel der aus Glucosinolaten gebildeten Nitrile in Pieris rapae Toxizität von Cyanid Cyanidentgiftung Entgiftungswege Cyanidentgiftung in Mikroorganismen Cyanidentgiftung in Pflanzen Cyanidentgiftung in Wirbeltieren Cyanidentgiftung in Arthropoden substituiertes Alanin-Synthasen Pyridoxal-5 -phosphat-abhängige Proteine des Faltungstyps II O-Acetylserin(thiol)lyase Cystathionin- -Synthase Cyanoalanin-Synthase Rhodanese und andere Schwefeltransferasen Zielsetzung Material und Methoden Versuchstiere und Futterpflanzen Pieris rapae Anthocharis cardamines Plutella xylostella Gonepteryx rhamni Arabidopsis thaliana Brassica oleracea var. gemmifera I

3 II 2.2 Biotests mit Insekten HCN-Begasung von P. rapae Fütterung von P. rapae mit A. thaliana Analytische Methoden Metabolitenextraktion aus Pieris rapae HPLC-MS/MS für Metabolitenuntersuchungen Probenvorbereitung für die HPLC-MS/MS-basierte Peptidanalytik HPLC-MS/MS-basierte Peptidanalytik Molekularbiologische Materialien und Methoden Plasmidvektoren Bakterienstämme Oligonukleotide Isolierung von RNA Reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion Standard-PCR Hotstart-PCR Touchdown-PCR PCR mit degenerierten Oligonukleotiden Semiquantitative PCR Vervollständigung der cdna-fragmente Full-length-PCR Kolonie-PCR Agarosegelelektrophorese und DNA-Aufreinigung aus dem Gel Photometrische Bestimmung von RNA-/DNA-Konzentrationen Ligation und Transformation Herstellung kompetenter E. coli-zellen Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli und Sequenzierung Uracil-specific excision reagent-klonierung Restriktionsverdau Dauerkultur gentechnisch veränderter Bakterien Überexpression der rekombinanten PrBSAS Proteinbiochemische Methoden Proteinextraktion und partielle Aufreinigung aus Raupen Zellernte und Aufschluss von rekombinanten PrBSAS Aufreinigung über den Strep-Tag und PD-10-Säulen Proteinbestimmung Bestimmung der Enzymaktivitäten... 58

4 Cyanoalanin-Synthase Rhodanese O-Acetylserin(thiol)lyase Polyacrylamidgelelektrophorese und Coomassiefärbung Western Blot Ergebnisse Produkte der Entgiftung von Cyanid in Pieris rapae Entgiftungsprodukte nach der Begasung mit Cyanid Methodische Herangehensweise der Begasungsversuche Cyanoalaninbildung nach Cyanidbegasung Thiocyanatbildung nach Cyanidbegasung Entgiftungsprodukte nach der Fütterung mit cyanogenen Pflanzen Methodische Herangehensweise der Pflanzenfütterungsversuche Cyanoalaningehalt nach dem Fraß von Pflanzen mit Cyanidvorstufen Thiocyanatgehalt nach dem Fraß von Pflanzen mit Cyanidvorstufen Aktivitäten von Cyanidentgiftungsenzymen in P. rapae Vorkommen von -Cyanoalanin-Synthase und Rhodanese in P. rapae Enzymaktivität in verschiedenen Entwicklungsstadien Verteilung der Enzymaktivitäten in Raupengeweben Induzierbarkeit der Enzymaktivitäten Induzierbarkeit durch Begasung mit Cyanid Induzierbarkeit durch Fütterung von Cyanidvorläufermolekülen Klonierung und Charakterisierung von -Cyanoalanin-Synthasen aus P. rapae Klonierungsstrategien für die -Cyanoalanin-Synthase Identifizierung von cdna-fragmenten putativer -Cyanoalanin-Synthasen Vervollständigung der cdna-sequenzen der -Cyanoalanin-Synthase- Kandidaten Induktionsuntersuchungen mittels semiquantitativer PCR Heterologe Expression von PrBSAS1, 2 und 3 und Aktivitätsnachweis im Rohextrakt Charakterisierung gereinigter rekombinanter PrBSAS1, 2 und Etablierung einer HPLC-MS/MS-Methode zum Nachweis von PrBSAS1, 2 und Klonierung von Rhodanese-Kandidaten aus P. rapae Vorkommen und Analyse von Cyanidentgiftungsenzymen in weiteren Lepidoptera-Arten Enzymaktivitätsbestimmungen mit Proteinextrakten aus Raupen III

5 Enzymaktivität in Anthocharis cardamines Enzymaktivität in Plutella xylostella Enzymaktivität in Gonepteryx rhamni Klonierung von partiellen cdna-sequenzen von -Cyanoalanin-Synthase- Kandidaten aus weiteren Lepidoptera-Arten Diskussion Mechanismen der Cyanidentgiftung in P. rapae Evolutive Aspekte der Cyanidentgiftung in den Lepidoptera Schlussfolgerungen und Perspektiven Fazit Weiterführende Untersuchungen zur Cyanidentgiftung in P. rapae Anwendung der Erkenntnisse für die Schädlingsbekämpfung Zusammenfassung Literatur Anhang Verbrauchsmaterialien, Apparaturen und Geräte Verwendete Oligonukleotide Methoden für die Peptid-HPLC-MS/MS Zusätzliche Daten IV

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