Untersuchungen zur Funktion von Stärke-Synthasen in der Kartoffel (Solanum tuberosum L.)

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1 Untersuchungen zur Funktion von Stärke-Synthasen in der Kartoffel (Solanum tuberosum L.) Inaugural-Dissertation Erlangung der Doktorwürde im Fachbereich Biologie der Freien Univeisität Berlin vorgelegt von Gemot J.W. Abel aus Heidelberg 1995

2 Inhaltsverzeichnis I. Einleitung Stärkebiosynthese in höheren Pflanzen Stärkeabbau Das Stärkekorn Biogenese und Struktur des Stärkekorns Initiation der Stärkesynthese ' Stärkekorn-gebundene Proteine Stärke-Synthasen Stärkekorn-gebundene Synthasen Lösliche Stärke-Synthasen Funktionale Analyse von Enyzmaktivitäten Inhibierung von Enzymaktivitäten in Mutanten und transgenen Pflanzen Überexpression von Enzymaktivitäten Ethische Betrachtung transgener Pflanzen Zielsetzung der Arbeit 19 II. Material 20 II. 1. n.2. U.3. II.4. II.5. n.6. II.7. n.8. H.9. Chemikalien und Enzyme Material und Geräte Oligonukleotide Bakterienstämme Vektoren und Plasmide Polyklonale Antikörper cdna-bänke Medien Pflanzen

3 III. Methoden 24 ULI. Isolierung Stärkekorn-gebundener Proteine Aufreinigung löslicher Stärke-Synthasen aus Kartoffelknollen 24 in.2.1. Rohextrakt 24 HI.2.2. DEAE-Chromatographie Amylose-"Resin"-Chromatographie Mono-Q-Chromatographie Klonierung und Sequenzierung 25 m.4. PCR-Amplifikation Transformationen Pflanzenhaltung "Southern-Blot"-Analyse "Northern-Blot"-Analyse Durchmusterung von cdna-bänken mit homologen oder heterologen DNA-Sonden 27 in. 10. Durchmusterung von cdna-bänken mit polyklonalen Antikörpern 27 m.11. Proteinanalyse 28 III Proteinbestimmung 28 III SDS-PAGE 28 m "Western-Blot"-Analyse 28 III. 12. Nachweis von Enzymaktivitäten 28 III Radioaktive Bestimmung der Stärke-Synthase-Aktivität 28 HI Nachweis von löslichen Stärke-Synthasen im nativen Gel 29 Iü Nachweis von STPII und Verzweigungsenzym in einem nativen Gel Quantifizierung von radioaktiven Signalen In vitro Synthese von a-l,4-glukanen Bestimmung des Xroax von in vitro produzierten a-l,4-glukanen Bestimmung von Stärke und löslichen Zuckern 30 ni.17. Stärkeanalyse 30 III Bestimmung der Stärkezusammensetzung 30 III Analyse der Seitenkettenlängenverteilung von Stärke 31 III Bestimmung des Phosphorylierungsgrades von Stärke 31

4 DI Viskositätsmessung 31 ÜI Messung der Absorption eines Stärkekleisters 32 III Analyse der Stärkekorngrößenverteilung 32 m.18. Mikroskopie von Stärkekörnern 32 IV. Ergebnisse 33 IV. 1. Aufreinigung und Identifizierung löslicher Stärke-Synthasen aus Kartoffelknollen 33 IV.2. IV.2.1. Klonierung von cdna-klonen, die für drei Stärke-Synthase-Isoformen aus Kartoffel kodieren 41 Klonierung einer für die GBSS II aus Kartoffel kodierenden VollängencDNA 41 IV Sequenzanalyse der GBSS II-kodierenden cdna 41 IV.2.2. Klonierung einer cdna, die für die lösliche Stärke-Synthase IH aus Kartoffel kodiert 44 IV Sequenzanalyse der SSS ffl-kodierenden cdna 45 IV.2.3. Klonierung einer cdna, die für die lösliche Stärke-Synthase I aus Kartoffel kodiert 48 IV Sequenzanalyse der SSS I-kodierenden cdna " 49 IV.2.4. Sequenzvergleich von SSS I, SSS in und GBSS U 52 IV.3. Immunologische Charakterisierung von Stärkekorn-gebundenen Synthasen in Speicherorganen verschiedener Pflanzenarten 54 IV.4. Expressionsanalyse von Genen, die für lösliche und Stärkekorngebundene Stärke-Synthasen aus Kartoffel kodieren 56 FV.4.1. Expression der für Stärke-Synthasen-kodierenden Gene in Organen der Kartoffelpflanze 56 IV.4.2. IV.5. IV.5.1. Induktion der Expression von Stärke-Synthase-kodierenden Genen durch Saccharose 57 Funktionale Analyse der Stärke-Synthasen SSS I, GBSS II und SSS m mit Hilfe von "Antisense"-Pflanzen 59 Auffinden von Kartoffelpflanzen mit reduziertem Gehalt an Stärke- Synthase-kodierender mrna 60 IV.5.2. Nachweis von reduziertem Gehalt an Stärke-Synthase-Protein in Knollen von "Antisense"-inhibierten Kartoffelpflanzen 62

5 IV.5.3. Untersuchung der eine reduzierte Menge an Stärke-Synthase mrna und Protein aufweisenden transgenen Pflanzen auf reduzierte Stärke- Synthase-Aktivität 63 IV.5.4. Quantifizierung der Stärke-Synthase-Aktivität in Stärke-Synthase- "Antisense"-Pflanzen IV.5.5. Einfluß der Inhibierung von Stärke-Synthase-Isoformen auf den Knollenertrag, Stärke- und Saccharosegehalt sowie den Phänotyp der transgenen Pflanzen 67 IV.5.6. Stärke-Analytik: Nachweis von Veränderungen der Stärkequalität in Stärke-Synthase-"Antisense"-Pflanzen 67 IV Untersuchung der Stärke aus SSS I-"Antisense"-Pflanzen 68 IV Untersuchung der Stärke aus GBSS n-"antisense"-pflanzen 70 IV Untersuchung der Stärke aus SSS ni-"antisense"-pflanzen 72 IV.7. Charakterisierung der Stärke-Synthase-Isoformen I und EI in E. coli 76 IV.7.1. Expression von SSS I, SSS in, GBSS I, GBSS H und Glykogen- Synthase in einer Mutante von E. coli 76 IV.7.2. Funktionale Charakterisierung von SSS I und HI in vitro _ V. Diskussion 84 V. 1. Aufreinigung von löslichen Stärke-Synthasen aus Kartoffelknollen 84 V.2. Klonierung und Sequenzanalyse von cdna-klonen, die für drei Stärke- Synthase-Isoformen aus Kartoffel kodieren 86 V.3. Expressionsmuster der Stärke-Synthase-kodierenden Gene 88 V.4. Funktionale Analyse der Stärke-Synthase-Isoformen mit Hilfe von "Antisense"-Pflanzen " 90 V.4.1. Stärke-Synthase-'Antisense"-Pflanzen 90 V.4.2. Charakterisierung der Stärke aus Stärke-Synthase-"Antisense"-Pflanzen 92 VI. Zusammenfassung 96 VII. Literaturverzeichnis 98

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