Multiplex Ligation Dependent Probe Amplification (MLPA): Einsatzmöglichkeiten bei hereditären Erkrankungen
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- Karsten Müller
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1 ÖÄK-Diplomkurs Genetik 2015 MLPA-Einsatzmöglichkeiten Multiplex Ligation Dependent Probe Amplification (MLPA): Einsatzmöglichkeiten bei hereditären Erkrankungen Assoc.-Prof. PD Dr. Jürgen Neesen Institut für Medizinische Genetik Medizinische Universität Wien
2 Überblick Vorbemerkungen Geschichte Protokoll Methodik Vor- und Nachteile der MLPA Einsatzmöglichkeiten Ausblick
3 Analyse des gesamten Genoms Chromosomenanalyse (Trisomie, Triploidie, Translokationen, Inversionen, Deletionen) molekular- / zytogenetische Methoden CGH Comparative Genomic Hybridisation (Deletionen, Duplikationen,Trisomien) NGS Next Generation Sequencing (Veränderungen einzelner Basen, Deletionen, Duplikationen, Trisomien) Analyse von Teilen des Genoms MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (Deletionen, Duplikationen) FISH Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (Deletionen, Duplikationen) Analyse von Teilen eines Gens Sequenz-Analyse (Veränderungen einzelner Basen) Restriktionsanalyse-Analyse (Veränderungen einzelner Basen)
4 Geschichte Nucleic Acids Res Jun 15;30(12):e57. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G. Source MRC-Holland, Hudsonstraat 68, 1057SN Amsterdam, The Netherlands.
5 Einführung MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) is a multiplex PCR method detecting abnormal copy numbers of up to 50 different genomic DNA or RNA sequences, which is able to distinguish sequences differing in only one nucleotide (1). The MLPA technique is easy to use and can be performed in many laboratories, as it only requires a thermocycler and capillary electrophoresis equipment. The over 300 probe sets now commercially available are dedicated to applications ranging from the relatively common (Duchenne, DiGeorge syndrome, SMA) to the very rare (hereditary pancreatitis, Antithrombin deficiency, Birt-Hogg-Dube syndrome). Vorteile: relativ kostengünstig relativ schnell übernommen von der MRC-Holland Homepage Nachteile: Interpretation nicht immer eindeutig gute DNA notwendig anfällig gegen SNPs
6 ÖÄK-Diplomkurs Genetik 2015 MLPA MLPA-Protokoll - DNA ( ng) bei C für ca. 5 min denaturieren - abkühlen auf 25 C - zu dem Ansatz werden Puffer und Sondenmix zugegen und ca. 16 h bei 60 C hybridisiert - Zugabe von Ligationspuffer und Ligase, bei 54 C 15 min inkubieren - Denaturierung bei 98 C für 5 min - abkühlen auf 25 C - Zugabe der PCR- Primer und Reagenzien (ein Primer FAM-markiert) - PCR 95 C C - 30 x35 Zyklen 72 C 60 - Zugabe von Foramid und markiertem Größenstandard und 2µl der PCR - Denaturierung 3 min 96 C auf 4 C abkühlen - Auftrennung im Kapillarsequenzer ca. 30 min - Datenerfassung ca. 30 min - Auswertung z. B. mit Seq-Pilot
7 MLPA-Einsatzmöglichkeiten - Deletionen / Duplikationen - Methylierungsdefekte - Aneuploidien [ - somatische Veränderungen (Tumoren) ] [ - transgene Tiere ] [ - Expressionsstudien ]
8 Methodik der MLPA Sequenz aus Exon2 des HNF1A -Gens (MODY3) Allel-1 Exon2 des HNF1A-Gens Allel-2 Allel-1 Allel-2 (Deletion)
9 MLPA-Struktur der Sonden MLPA-3 -Sonde (45-76 Nukleotide) MLPA-5 -Sonde (45-76 Nukleotide) PCR-Primer Puffersequenz Zielsequenz ~23 nt 1-34 nt nt P T G C C T C C A G C T A T G G Zielsequenz Puffersequenz PCR-Primer HO nt 2-36 nt 19 nt T G A C C G G A G T C G G A G T T T G A C C
10 MLPA-Methodik Ligase Hybridisierung der Sonden mit der denaturierten genomischen DNA P C C A G C T A T G G T G A C C G G A G T 5 - A G G T G G T C G A T A C C A C T G G C C T C A A C C A G T C C C A C C T G T C C C -3 Ligation C C A G C T A T G G T G A C C G G A G T 5 - A G G T G G T C G A T A C C A C T G G C C T C A A C C A G T C C C A C C T G T C C C -3 Trennung: ligierter Primer von genomischer DNA 3 - T G C C T C C A G C T A T G G T G A C C G G A G T C G G A G T T T G A C C - 5
11 3 - T G C C T MLPA-Methodik C C A G C T A T G G T G A C C G G A G T C G G A G T T T G A C C - 5 A C G G A A C G G A A C G G A Fluoreszenz markierte Primer T G A C C T G A C C T G A C C 3 - T G C C T A C G G A TAQ-Polymerase C C A G C T A T G G T G A C C G G A G T C G G A G T T T G A C C C Aufschmelzen und Primeranlagerung TAQ-Polymerase - 5 TAQ-Polymerase
12 MLPA-Methodik Amplifikation Kontrolle Patient Deletion
13 MLPA-Methodik Kapillarsequenzeranalyse Pufferfragment 238 nt 216 nt 198 nt Für die Größe des Signalpeaks ist die Anzahl der Molekühle entscheidend, nicht die Anzahl der Nukleotide.
14 ÖÄK-Diplomkurs Genetik MLPA MLPA-Analyse Patient Deletion/Mutation Duplikation Kontrolle
15 MLPA-Methodik
16 CMT1A- MLPA Charcot-Marie-Tooth-Erkrankung Typ IA (CMT1A) Hereditäre motorische und sensorische Neuropathie (HMSN1A) Distale Muskelschwäche Greiffußstellung, distale Muskelatrophie - Distale (peroneale) Muskelatrophie und schwäche, - Hohlfuß, Finger- u. Zehenkontrakturen, Skoliose, - verminderte tiefe Sehnenreflexe und Nervenleitgeschwindigkeit, - sensorische Defekte - trophische Gewebsveränderungen, Fußulcera - Herzblock, Diarrhoe - zwiebelschalenförmige Verdickungen der peripheren Nerven Beginn mit etwa 12 Jahren, langsam progredient, AD Genduplikationen oder aktivierende Punktmutationen im PMP22-Gen (Chromosom 17p11.2) PMP = peripheres Myelinprotein
17 CMT1A- MLPA ca. 1,4 Mb Duplikation von PMP22 Heterozygote Deletion von PMP22 CMT1A HMSN I (Hereditäre motorisch-sensible Neuropathie) HNPP (Hereditäre Neuropathie mit Neigung zu Drucklähmungen)
18 CMT1A- MLPA FISH-Analyse
19 PMP22 CMT1A- MLPA PMP22 DNA-einzelsträngig Primer-Bindung Ligation Kontroll-Gen Trennung PCR 229 bp 238 bp 292 bp 355 bp
20 CMT1A- MLPA 229 bp 238 bp 292 bp 355 bp Fragmente werden in der Kapillar - Elektrophorese der Größe nach aufgetrennt und detektiert. Aus der Fläche der Peaks wird das Verhältnis berechnet. Verhältnis der Amplifikate: bei Duplikation => 3:2 PMP22 / Kontroll-Gen keine Duplikation => 1:1 bei Deletion => 1:2
21 Keine Duplikation CMT1A- MLPA Duplikation PMP22 Kontroll-Gen
22 CMT1A- MLPA
23 MLPA-Aneuloidiescreening European Journal of Human Genetics (2005) 13, Computer-assisted prenatal aneuploidy screening for chromosome 13, 18, 21, X and Y based on multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) Tommy Gerdes, Maria Kirchhoff, Anne-Marie Lind, Gitte Vestergaard Larsen, Marianne Schwartz and Claes Lundsteen Department of Clinical Genetics, Rigshospitalet, Copenhagen, Denmark Correspondence: Dr M Kirchhoff, Department of Clinical Genetics, 4052, Rigshospitalet, DK-2100 Copenhagen Ø, Denmark Proben wurden untersucht: Karyotypisierung und MLPA 809 Amniozentesen 784 Chorionzottenbiopsien 27 Aneuploidien konnten detektiert werden 3,2% der Untersuchungen ergaben kein eindeutiges Ergebnis
24 Prader-Willi- / Angelman-Syndrom el/prader%20willi%20syndrome high/420b.gif
25 Prader-Willi- / Angelman-Syndrom Prader-Willi-Syndrom > 99% der PWS-Patienten können durch eine Deletions- und Methylierungsmuster - Analyse erkannt werden. Angelman-Syndrom 70-75% der AS-Patienten können durch eine Deletions- und Methylierungsmuster - Analyse erkannt werden.. übernommen von Buiting, 2010, Am J Med Genet 154:365
26 Methylierungs-spezifische MLPA Prader-Willi- / Angelman-Syndrom-Region acccctgcactgcggcaaacaagcacgcctgcgcggccgcagaggcaggc Ausschnitt aus der 5 -Region des SNRPN-Gens
27 X X ÖÄK-Diplomkurs Genetik 2015 MLPA Methylierungs-spezifische MLPA HhaI-Restriktionsenzym sensitiv gegenüber methylierten CpGs NNNGCGCNNN NNNCGCGNNN CH3 NNNGCGCNNN NNNCGCGNNN CH3 Keine Metyhlierung - DNA wird geschnitten ist die DNA metyhliert, wird sie durch HhaI nicht geschnitten NNNGCG CNNN NNNC GCGNNN CH3 NNNGCGCNNN NNNCGCGNNN CH3
28 Methylierungs-spezifische MLPA HhaI Sequenz aus dem Bereich des paternalen aktiven SNRPN-Gens T T T G T T C G T G C G G A C G C G C C 5 - a c c c c t g c a c t g c g g c a a a c a a g c a c g c c t g c g c g g c c g c a g a -3 DNA nicht methyliert MLPA-Sonde wird geschnitten T T T G T T C G T G C G G A C keine PCR-Amplification G C G C C
29 Methylierungs-spezifische MLPA HhaI T T T G T T C G T G C G G A C G C G C C 5 - a c c c c t g c a c t g c g g c a a a c a a g c a c g c c t g c g c g g c c g c a g a -3 Sequenz aus dem Bereich des maternalen inaktiven SNRPN-Gens CH3 DNA methyliert MLPA-Sonde wird nicht geschnitten PCR-Amplification
30 Methylierungs-spezifische MLPA maternales Chromosom 15 SNRPN-Gen ist methyliert paternales Chromosom 15 SNRPN-Gen ist nicht methyliert normaler Zustand keine PCR-Amplification 50% Amplifikate Allele 1 SNRPN-Gen Chromosom 15 Allele 2 SNRPN-Gen Chromosom % Amplifikate ist methyliert maternales Allel ist methyliert maternales Allel maternale UPD 15 PWS
31 ÖÄK-Diplomkurs Genetik 2015 MLPA MLPA zum Nachweis von Mikrodeletionen Mikrodeletionssyndrome FISH-Test an Metaphase-Chromosomen WBS-Sonde 7q11.23 liegen unterhalb des Auflösungsvermögens des Lichtmikroskops Abklärung einer Deletion von 5-10 Mb Bandenlevel: ~500 Banden ~ durchschnittlichen Bandengröße: 5-10 Mb ~ Gene In der Regel erfordern Deletionen unter 2-5 Mb molekulare Methoden Kontrollsonde
32 MLPA zum Nachweis von Mikrodeletionen SALSA MLPA P064 Mental Retardation-1 probemix application: Mental Retardation; 1p-deletion, Williams, Smith-Magenis, Miller-Dieker, DiGeorge, Prader-Willi, Alagille, Saethre-Chotzen, Sotos
33 MLPA zur Überprüfung von Array-CGH-Daten Mol Cytogenet. 2010; 3: 19. MLPA for confirmation of array CGH results and determination of inheritance Alison Hills, Joo Wook Ahn, Celia Donaghue, Helen Thomas, Kathy Mann, and Caroline Mackie Ogilvie Array-CGH
34 Zusammenfassung Die MLPA ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode zum Nachweis von Verlusten bzw. Zugewinnen von genetischem Material in definierten Regionen des Genoms. Zudem kann sie bei Verdacht auf Methylierungsdefekten eingesetzt werden. Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!
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