Die Rolle des CD95/CD95L-Systems bei der Aktivierung primärer humaner T-Lymphozyten

Transkript

1 Die Rolle des CD95/CD95L-Systems bei der Aktivierung primärer humaner T-Lymphozyten DISSERTATION zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel vorgelegt von Maren Paulsen Kiel 2010

2 Referent: Professor Dr. Stefan Rose-John Korreferent: Professor Dr. Dr. Thomas Bosch Tag der mündlichen Prüfung: 29. Januar 2010 Zum Druck genehmigt: 29. Januar 2010 gez. Professor Dr. Lutz Kipp, Dekan

3 Zusammenfassung Zusammenfassung Der Todesfaktor CD95L ist bekannt für seine Fähigkeit apoptotischen Zelltod in CD95-sensitiven Zellen zu induzieren. Es häufen sich jedoch seit einiger Zeit Hinweise auf zusätzliche anti-apoptotische Funktionen des CD95/CD95L-Systems in verschiedenen Zellsystemen. Genaue molekulare Mechanismen der retrograden Signalgebung über CD95L wie auch der anti-apoptotischen Aktivität von CD95 sind dabei jedoch weitgehend unbekannt, insbesondere im Kontext der Aktivierung ruhender humaner T-Lymphozyten. Ein Aspekt der vorliegenden Arbeit war daher die Untersuchung des Todesfaktors CD95L als kostimulatorischer bzw. inhibitorischer Rezeptor im Rahmen der TZR/CD3/CD28-induzierten Aktivierung primärer humaner T-Zellen. Hier konnten wir eine Blockade der T-Zellproliferation bei gleichzeitiger Stimulation über CD3/CD28 und CD95L mit immobilisierten, nicht aber mit löslichen Fusionsproteinen und Antikörpern nachweisen. Bereits frühe Phasen der Signalinduktion waren betroffen. Neben dem Ras/Raf/MEK/ERK1/2-Signaltransduktionsweg waren auch Schlüsselmoleküle der proximalen TZR-Signalgebung wie PLCγ, LAT und ZAP-70 inhibiert. Die Untersuchungen zu diesem Themenbereich wurden Anfang 2009 publiziert (142). Darüber hinaus wurde in dieser Arbeit der Todesrezeptor CD95 als potenziell kostimulatorischer Rezeptor untersucht. Interessanterweise konnte für CD95 ein dosisabhängiger Einfluss auf die TZR/CD3/CD28-Signalgebung in T-Zellen nachgewiesen werden. So konnte gezeigt werden, dass eine hohe Konzentration der CD95-Agonisten in einer kompletten Blockade der T-Zell-Signalwege resultiert. Diese Befunde decken sich in allen untersuchten Parametern mit den Mitte 2009 publizierten Daten der Arbeitsgruppe um Gudrun Strauß (53). Im Gegensatz dazu führten geringere Konzentrationen zu einer deutlich gesteigerten Proliferation. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde dieser Effekt erstmals für eine Reihe unterschiedlicher CD95-Agonisten (Fusionsproteine und mak) dokumentiert. Die gesteigerte Zellteilungsrate ging einher mit verstärkter Expression von Aktivierungsmarkern, erhöhter IL-2-, TNFα- und IFNγ-Produktion, verstärkter MAPK- Aktivierung und der Hochregulation von Zellzyklusproteinen. Weiterhin zeigten die Zellen eine erhöhte Apoptose-Resistenz, die mit dem Auftreten von p22-flip, cflip R/S und NF-κB- Zielgenen wie Bcl-X korrelierte. Im Einklang mit der inzwischen auch in der Literatur

4 Zusammenfassung dokumentierten Notwendigkeit der Caspase-Aktivierung im Rahmen der Proliferation, war die Prozessierung der Caspasen-3 und -8 unter diesen Bedingungen ebenfalls gesteigert. Erste Untersuchungen an mutierten Mäusen, deren CD95L nur aus der Transmembran- und extrazellulären Domäne besteht, unterstützen nicht die Annahme, dass CD95L als retrograder Signalgeber fungieren kann. Weitere Untersuchungen sind jedoch notwendig, um diese Frage abschließend zu klären. Das kostimulatorische Potenzial von CD95 bei der Aktivierung ruhender T-Zellen wurde allerdings auch bei der Verwendung von murinen Milzzellen und humanen Agonisten untermauert. Zusammenfassend hat das CD95/CD95L-System eindeutig eine modulatorische Funktion im Rahmen der Aktivierung primärer T-Lymphozyten. Unsere Befunde und die diskutierten Daten anderer Arbeitsgruppen weisen darauf hin, dass die Interaktion zwischen gering exprimiertem CD95L auf APZ und CD95 auf T-Zellen im Zuge einer Immunantwort zunächst zur verstärkten Aktivierung, Proliferation und Expansion der T-Zellen führt. Im weiteren Verlauf der Immunreaktion wird CD95L auf APZ oder benachbarten T-Zellen vermehrt exprimiert und trägt durch Inhibition der Aktivierung weiterer T-Zellen zur Beendigung der Immunantwort bei. Aktivierte T-Zellen werden über denselben Rezeptor durch die Induktion von Apoptose eliminiert, während primäre T-Zellen durch Blockade des Signals 1 inhibiert werden. In diesem Zusammenhang wird postuliert, dass Pathogene wie HIV über die Induktion von CD95L auf T-Zellen und APZ die gegen virusinfizierte Zellen gerichtete Immunantwort supprimieren.

5 Summary Summary The death factor CD95L is best known for its capacity to induce apoptotic cell death in CD95-sensitive cells. Recently however, emerging evidence pointed at additional antiapoptotic functions of the CD95/CD95L-system in various cellular systems. The exact molecular mechanisms regulating CD95L reverse signaling or the anti-apoptotic activity of CD95 in the context of primary human T cell activation had not been elucidated. One aspect of the present work addresses the investigation of CD95L as a costimulatory receptor for TCR/CD3/CD28-induced activation of primary human T lymphocytes. Here we detected a complete block of T cell proliferation by simultaneous stimulation via CD3/CD28 and CD95L with immobilized, but not soluble fusion proteins or antibodies. Most early T cell signaling events that we tested were negatively affected. Specifically, besides the Ras/Raf/MEK/ERK1/2 signal transduction pathway and calcium flux, key molecules of proximal TCR-signaling including LAT, ZAP-70 and PLCγ were inhibited. Our results on the putative retrograde signaling through CD95L were recently published in the journal International Immunology. Moreover, we analyzed the role of the death receptor CD95 as a potential costimulatory molecule. We could demonstrate that CD95 influences the TCR/CD3/CD28- induced activation and signaling of primary T cells in a dose- or threshold-dependent manner. In agreement with recent data by others, high doses of CD95-agonists resulted in a complete block of T cell activation. In our hands, however, the same agonists used at low concentrations drastically augmented T cell proliferation. We confirmed the dose-dependency for a number of different CD95 agonists (i.e. various fusion proteins and monoclonal antibodies). CD95 costimulation was associated with non-apoptotic processing of caspase-3 and -8, enhanced MAPK activation and with higher levels of cell-cycle regulator proteins, anti-apoptotic proteins including p22-flip, cflip R/S and the NF-κB target gene Bcl-X. The alterations led to a massive proliferation of the whole population with a uniform upregulation of activation markers and the enhanced production of IL-2, TNFα and IFNγ. Moreover, the cells displayed increased apoptosis resistance.

6 Summary To address the contribution of the intracellular region of CD95L in this context, we used mutated mice devoid of this domain (available through Martin Zörnig, Frankfurt). However, the initial experiments did not support the idea of a CD95L retrograde signaling capacity whereas the costimulatory potential of CD95 was also supported in this scenario. In summary, we show that the CD95/CD95L system may direct the activation of primary human T lymphocytes. From our results, in conjunction with recent observations reported by others, one can hypothesize that the interaction of CD95 with low level CD95L (as for instance present on antigen presenting cells (APC)) augments primary T cell activation and expansion at the onset of an immune response. If activated APC upregulate CD95L, based on the threshold level, the same set of molecules will elicit the termination of the immune response by the induction of cell death in activated T cells and by inhibiting the activation of resting T cells. Concerning retrograde CD95L signaling and its impact on T cell function, further experiments and more detailed analyses of immune parameters are required using the different mutant mice that are meanwhile available.