MOSC-Proteine aus Escherichia coli, Homo sapiens, Mus musculus und. Arabidopsis thaliana

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1 Untersuchung Molybdäncofaktor-haltiger MOSC-Proteine aus Escherichia coli, Homo sapiens, Mus musculus und Arabidopsis thaliana Von der Fakultät für Lebenswissenschaften der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Dissertation von Debora Anne Reichmann aus Hachenburg

2 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Der Molybdäncofaktor Die Familie der MOSC-Proteine Die prokaryotischen MOSC-Proteine YcbX und YiiM Das eukaryotische MOSC-Protein marc Zielsetzungen der Arbeit 12 2 Ergebnisse Die prokaryotischen MOSC-Proteine YcbX und YiiM Sequenzanalysen von YcbX und YiiM Klonierung, Expression und Aufreinigung von YcbX und YiiM Charakterisierung von YcbX und YiiM als Moco-haltige MOSC-Proteine Untersuchungen zum putativen Eisen-Schwefel-Cluster von YcbX Charakterisierung der putativen Elektronendonoren CysJ und Fre Untersuchungen der Oligomerisierung und Interaktion Untersuchungen zur Reduktion von N-hydroxylierten Verbindungen durch YcbX und YiiM Funktion des 2Fe2S-Clusters von YcbX Das eukaryotische MOSC-Protein marc Optimierung der Aufreinigung von marc, Cytochrom b; und Cytochrom ^Reduktase Expression und Aufreinigung der nicht-trunkierten humanen marc-proteine in Pichiapastoris Kristallisation des humanen marc-1 Proteins Generierung und Charakterisierung von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen in den humanen marc-proteinen und des humanen Cytochrom bs Oligomerisierung von marc Untersuchungen zu Interaktionen von marc aus Mus musculus und Arabidopsis thaliana Lokalisierungs- und Expressionsstudien der pflanzlichen marc-proteine ms Arabidopsis thaliana Untersuchung des Expressionslevels von pmarc-1 und pmarc-2 auf mrna-ebene 52

3 Subzelluläre Lokalisierung von mit Venus-fusiomerten pmarc-proteinen in Arabidopsis thaliana und Nicotiana benthatniana Isolierung von pmarc-1 aus Arabidopsis thaliana Generierung eines marc-knockout mittels Zink-Finger-NukleasefO Technologie in Mus musculus Transfektion muriner embryonaler Stammzellen mit Zink-Finger-Nukleasen Transfektion muriner embryonaler Stammzellen mit Zink-Finger-Nukleasen und Donorplasmid 2.3 Untersuchungen zur Funktion des konservierten MOSC-Cysteins in pro- und eukaryotischen MOSC-Proteinen Biochemische Charakterisierung der MOSC-Cystein-Varianten Die Funktion des konservierten MOSC-Cysteins 7' 3 Diskussion ^ 3.1 Analyse der prosthetischen Gruppen von YcbX und YiiM Untersuchung der putativen Elektronentransportproteine CysJ und Fre Reduktion N-hydroxylierter Verbindungen durch YcbX und YiiM Ist der 2Fe2S-Clusters ein intramolekularer Elektronenüberträger? Die Funktion des konservierten MOSC-Cysteins in YcbX Untersuchungen der humanen marc-proteine im Hinblick auf Expression im eukaryotischen System, Oligomerisierung und Interaktion Einfluss von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen der marc-proteine auf die Effizienz der Prodrug-Aktivierung Expression unter Stressbedingungen und Lokalisierung der pflanzlichen marc-proteine aus Arabidopsis thaliana Generierung einer Knockout-Maus-Linie zur Untersuchung der physiologischen Funktion der marc-proteine Mögliche physiologische Funktionen der marc-proteine 91 4 Material und Methoden Materialien Organismen Plasmide Primer 95 4-' ^ Antikörper und Konjugate 99 4-' 5 Chemikalien und Zellkulturmedien 99 ^

4 4.1.6 Materialien und Geräte Molekularbiologische Methoden Herstellung rekombinanter DNA-Konstrukte Isolierung genomischer DNA Genomische DNA aus Mus musculus Genomische DNA aus Escherichia coli Isolierung von RNA Gesamt-RNA aus Pflanzen Gesamt-RNA aus Mus musculus Reverse Transkriptase-Reaktion Polymerase-Kettenreaktion Klonierungs-PCR Mutagenese-und Fusions-PCR Gateway-Klonierung Cel-I Assay zur Analyse putativ positiver Stammzellklone DNA-Sequenzierung Biochemische Methoden Überexpression rekombinanter Proteine in Escherichia coli Überexpression rekombinanter Proteine in Pichiapastoris Affinitätschromatographische Aufreinigung His6-getaggter Proteine Affinitätschromatographische Aufreinigung GST-getaggter Proteine Affinitätschromatographische Aufreinigung StrepII-getaggter Proteine Ionenaustauscherchromatographie Anionenaustauscherchromatographie Kationenaustauscherchromatographie Größenausschlusschromatographie Bestimmung von Proteinkonzentrationen Umpuffern von Proteinen Ankonzentrieren von Proteinen Crosslinking Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese D-Gelelektrophorese Silberfärbung von Proteingelen 116

5 Immunologischer Nachweis von Proteinen (Immunblot) Proteinsequenzierung H g Proteinidentifizierung mittels MALDI-TOF und LC-MS Bestimmung des säurelabilen Schwefels der Eisen-Schwefel-CIuster Bestimmung des Eisengehaltes von Proteinlösungen M/-7-Rekonstitutionsassay H Quantifizierung des MPT/Moco-Gehaltes Nachweis von MPT/Moco-haltigen Fraktionen FormA-dephospho Analyse ICP-MS Analyse FAD/FMN Bestimmung Identifizierung von gebundenem Flavin mittels SDS-Behandlung Spektroskopische Methoden Zirkulardichroismus-Spektroskopie Elektronenspinresonanz-Spektroskopie Methoden zur Bestimmung der Proteinaktivität HPLC-basierte Aktivitätsmessung der MOSC-Proteine Methylviologen-basierte Aktivitätsmessung der MOSC-Proteine Superoxid-Dismutase-sensitive Reduktion von Cytochrom c durch O2" In-Gel Aktivitätsassay für Xanthindehydrogenase und Aldehydoxidase Methoden der tierischen Zellkultur Kulturbedingungen Kultivierung und mitotische Inaktivierung muriner embryonaler Fibroblasten Kultivierung muriner embryonaler Stammzellen Transfektion embryonaler Stammzellen durch Elektroporation Arbeiten mit Arabidopsis thalianauxid Nicotiana benthamiana Pflanzenanzucht Indirekter Gentransfer durch Infiltration von Agrobacterium tumefaciens in Pflanzen Direkter Gentransfer in Pflanzen mittels Partikelkanone Zusammenfassung Literaturverzeichnis 132