Untersuchungen zur Phytochemie und zur biologischen Aktivität von Actaea racemosa L.

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1 <f> Untersuchungen zur Phytochemie und zur biologischen Aktivität von Actaea racemosa L. Inauguraldissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald vorgelegt von Kristian Wende geboren am 20. Dezember 1973 in Berlin-Friedrichshain Greifswald, November 2003

2 INHALTSVERZEICHNIS Abkürzungsverzeichnis 1 EINLEITUNG 1 2 THEORETISCHER TEIL Botanik der Pflanze Inhaltsstoffe Knochen - Aufbau, Umbau, Regulation Einführung Der anatomisch-histologische Aufbau des Knochens Hormonelle Regulierung des Knochenumbaus und der Calciumhomöostase Einfluss der Sexualhormone auf den Knochen Regulation der Osteoklastogenese via RANKL/RANK/OPG Eigenschaften und Regulation der Osteoblasten Eigenschaften der Osteoblasten Regulation der Osteoblastogenese Die Krankheit Osteoporose Pathogenese Therapie der Osteoporose Wirkungsmechanismen antiresorptiver Substanzen Zellkulturmodelle Osteoklasten Osteoblasten 25 3 MATERIAL UND METHODEN Gewinnung, Isolierung und Charakterisierung von Extrakten und Reinsubstanzen aus Actaea racemosa , Extraktgewinnung Dünnschichtchromatographische Methoden Normalphasen-Dünnschichtchromatographie Reversed-phase-Dünnschichtchromatographie Sprühreagenzien und Dokumentation Präparative und analytische säulenchromatographische Methoden Offene Säulenchromatographie Methoden der Mitteldruck-Chromatographie (MPLC) Methoden der Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) Säulenchromatographie auf Polyamid SC Derivatisierung der MPLC-Fraktion Strukturanalytische Methoden Bestimmung des Schmelzpunktes Massenspektroskopie IR-Spektroskopie Optische Drehung NMR-Spektroskopie Qualitativer und quantitativer Nachweis von Zuckern aus Actaea racemosa Identifizierung der Zuckerkomponente in isolierten Triterpenglykosiden 37

3 Identifizierung der Zuckerkomponenten in der TTG-Fraktion Identifizierung der Zuckerkomponenten in der Harzfraktion (HF) Quantitative Kohlenhydratbestimmung Vergleich unterschiedlicher Extraktchargen von Actaea racemosa hinsichtlich der Zusammensetzung der Triterpenglykosid-Fraktion Dünnschichtchromatographie RP18-HPLC Quantitative Bestimmung der Triterpenglykoside Actaeaepoxid und Actein Untersuchungen zur Zusammensetzung der Harzfraktion (HF) von Actaea racemosa Zellbiologische Untersuchungen Kultivierung von HOS 58-Osteosarkomzellen Routinekultivierung HOS 58-Zellen HOS 58-Zellsuspensionen für die biologische Testung Kultivierung von SaOS-2-Osteosarkomzellen Routinekultivierung von SaOS-2-Zellen Gewinnung von SaOS-2-Zellsuspensionen für die biologische Testung Kultivierung von MCF-7-Zellen Testung an HOS 58-Osteosarkomzellen Testung an SaOS-2-Osteosarkomzellen Testung an MCF-7-Zellen Zelllyse und Solubilisierung zellulärer Proteine Ermittlung des geeigneten Zelllysepuffers Vergleich des Zellaufschlusses durch freeze/thawing und Ultraschall Standardmethode für Zellaufschluss Proteinbestimmung im Zelllysat Bestimmung der Aktivität der zellulären Alkalischen Phosphatase Kalibrationskurve für 4-Nitrophenol Charakterisierung der Alkalischen Phosphatase Untersuchungen zur Thermostabilität Hemmbarkeit durch einen spezifischen Inhibitor Bestimmung der Zellzahl Bestimmung von Interleukin 6 im Kulturüberstand Stimulierung von Osteosarkomzellen mit Extrakten und Reinstoffen Stimulierung von HOS 58-Zellen Stimulierung von SaOS-2-Zellen Mineralisationsexperimente an verschiedenen Osteosarkomzelllinien Voruntersuchungen zur /o-vzyro-mineralisation Stimulierung der/«-v/yro-mineralisation von SaOS-2-Zellen Nachweis der Mineralisation durch die VON KOSSA-Färbung Nachweis der Mineralisation durch die Alizarin-Färbung Zellkultivierung auf Plasma- und Biomolekül-modifizierten Oberflächen Auswahl des zur Beschichtung geeigneten Biomoleküls Eignung von Plasma-modifiziertem Polystyren NH3-Plasma-Behandlung von Multiwellplatten Collagen-Beschichtung von NH3-Plasma behandelten Multiwellplatten Adhäsion von Osteosarkomzellen an unterschiedlichen Zellkulturoberflächen Zellkultivierung auf Plasma-modifizierten und beschichteten Oberflächen 63 4 ERGEBNISSE Isolierung und Charakterisierung von Extrakten und Inhaltsstoffen 65

4 4.1.1 Extraktion und Isolierung von Triterpenglykosiden Extraktgewinnung Vortrennung der Triterpenglykosid-Fraktionen Trennung des Triterpenglykosid-Gemisches nach Derivatisierung Trennung der Sammelfraktion 3 und deren Subfraktionen durch MPLC Semipräparative HPLC - Isolierung der Triterpenglykoside Xi, X2 und X Strukturaufklärung der isolierten Verbindungen Xj und X Schmelzpunktbestimmung IR-Spektrum Massenspektrometrie Optische Drehung NMR-Daten und Struktur der Verbindung Xi NMR-Daten und Struktur der Verbindung X Identifizierung der Zuckerkomponente von Actaeaepoxid (Xi) und Cimigosid (X2) Das Triterpenglykosid-Muster verschiedener Extraktchargen Unbehandelte Triterpenglykosid-Fraktion Sammelfraktion 1 der TTG-Fraktion Sammelfraktion 2 der TTG-Fraktion Sammelfraktion 3 der TTG-Fraktion Gehalt von Actaeaepoxid und Actein in der Triterpenglykosid-Fraktion Untersuchungen zur Zusammensetzung der Harzfraktion (HF) HPLC-Trennung der Harzfraktion Trennung der Harzfraktion an Polyamid Analytik der Polyamid-Fraktionen Ergebnisse der quantitativen Kohlenhydratbestimmung Untersuchungen zur Zuckerkomponente in der Triterpenglykosid-Fraktion Zellbiologische Untersuchungen Solubilisierung der Zellproteine von HOS 58-Osteosarkomzellen Ermittlung eines geeigneten Zelllysepuffers Zellaufschluss durch freeze/thawing und Ultraschall Charakterisierung der Alkalischen Phosphatase aus HOS 58- und SaOS-2- Osteosarkomzellen Untersuchungen zur Thermostabilität Verhalten gegen (-)-p-bromotetramisol Bestimmung der Enzymaktivität der Alkalischen Phosphatase Bestimmung der Konzentration von 4-Nitrophenol Ermittlung der Protein-Konzentration im Zelllysat (Methode nach SMITH) Aktivität der Alkalischen Phosphatase von HOS 58-Osteosarkomzellen unter Einfluss von Test-,und Kontrollsubstanzen Einfluss von chemisch-definierten Substanzen Einfluss von Naturstoffen Zeitabhängigkeit der zellulären Enzymaktivität Aktivität der Alkalischen Phosphatase von SaOS-2-Osteosarkomzellen Produktion durch HOS 58- und SaOS-2-Osteosarkomzellen unter Einfluss von Substanzen aus Actaea racemosa SaOS-2-Osteosarkomzellen HOS 58-Osteosarkomzellen Der Einfluss von verschiedenen Extrakten aus Actaea racemosa auf die 11-6 Produktion von HOS 58-Zellen HOS 58 und Zellkulturoberfläche 119

5 4.2.7 /«-v/^ro-mineralisation von SaOS-2- und HOS 58-Osteosarkomzellen unter Einfluss von Actaea racemasa-extrakten HOS 58-Osteosarkomzellen SaOS-2 Osteosarkomzellen Zellkultur von Osteosarkomzellen auf modifizierten Zellkulturoberflächen Auswahl des zur Beschichtung der Zellkulturoberfläche geeigneten Biomoleküls Zellwachstum auf mikrostrukturiertem Polystyren Eigenschaften von Ammoniak-Plasma modifiziertem Polystyren Adhäsion von HOS 58-Zellen an unterschiedlichen Zellkulturoberflächen Adhäsion von SaOS-2 -Zellen an unterschiedlichen Zellkulturoberflächen Zellkultivierung auf Plasma-modifizierten und beschichteten Oberflächen BrdU-Einbau in MCF-7-Zellen unter Einfluss von Substanzen aus A. racemosa DISKUSSION Phytochemie Triterpene von Cycloartenoltyp Analytik D^ünnschichtchromatographie HPLC-Analytik Extraktgewinnung und Zusammensetzung der Triterpenglykosid-Fraktion Actaeaepoxid Cimigenol-3-O-ß-D-xylopyranose Isolierung weiterer Triterpene aus den Fraktionen 3.3 und Zusammensetzung der Harzfraktion Kohlenhydrat-Gehalt Triterpenglykosid-Muster und Chargen-Vergleich Ergebnisse der biologischen Testung Osteosarkomzellen und Testmodell Testung Osteoblasten-Modell I: Alkalische Phosphatase der HOS 58-Osteosarkomzellen Osteoblasten-Modell II: Mineralisation von SaOS-2-Osteosarkomzellen in-vitro Interleukin 6-Produktion durch osteoblastische Osteosarkomzellen Einfluss von Naturstoffen auf HOS 58- und SaOS-2-Osteosarkomzellen Modifikation von TCPS und Biomolekül-Beschichtung der Zellkulturoberfläche ZUSAMMENFASSUNG LITERATURVERZEICHNIS 191 ANHANG 213