HPLC-Versuch: Stabilität von Omeprazol
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- Eike Krause
- vor 6 Jahren
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1 HPLC-Versuch: Stabilität von meprazol Vorbesprechung: N S N NH Allgemeine Grundlagen HPLC (Aufbau, Zweck der Bestandteile, mobile Phase, Theorie) meprazol (Struktur, Umlagerung im Sauren, Softdrugs, Targeted Drugs, Prodrugs, Arzneimittel mit meprazol in technologischer Hinsicht, Pharmakologie) Sie sollten auch alle Begriffe in der folgenden Anleitung verstehen und sowohl wissen, worum es bei dem Versuch geht, als auch, was Sie zu tun haben. (Also bitte rechtzeitig gründlich lesen!) Empfohlene Literatur u.a.: Rücker, Mutschler, Steinhilber Gerhard Rücker, Michael Neugebauer, und Günter Georg Willems: Instrumentelle pharmazeutische Analytik: Lehrbuch zu spektroskopischen, chromatographischen, elektrochemischen und thermischen Analysenmethoden, September 2007 oder Januar 2001 Ernst Mutschler, Gerd Geisslinger, Heyo K. Kroemer, und Monika Schäfer- Korting: Arzneimittelwirkungen, Januar 2001 oder Mutschler, Gerd Geisslinger, Heyo K. Kroemer, und Peter Ruth: Arzneimittelwirkungen, April 2008 Dieter Steinhilber, Manfred Schubert-Zsilavecz, und Hermann J. Roth: Medizinische Chemie: Targets und Arzneistoffe, Mai 2005 Versuchsablauf: Die Anlage darf nur von Assistenten bedient werden!!! Die Probenvorbereitung erfolgt in Zweier- bzw. Dreier-Gruppen. Nehmen Sie sich für den entsprechenden Praktikumstag nichts anderes im Labor vor; es ist wichtig, dass die Probenvorbereitung spätestens 1 Stunde vor Ende des Praktikumstages abgeschlossen ist, damit die Anlage am folgenden Tag für die nächste Gruppe frei ist.
2 In diesem Versuch wird die Stabilität von meprazol in Gegenwart von Säure mittels HPLC zu untersucht. Dazu wird meprazol in Salzsäure gelöst und zu bestimmten Zeitpunkten mit Natronlauge neutralisiert. Mit der HPLC-Messung können Sie den Abbau des meprazols und die Entstehung der Abbauprodukte beobachten. Damit nicht alle Gruppen genau die gleichen Ergebnisse erhalten, wird der Versuch in zwei Varianten durchgeführt, einmal mit konzentrierter Säure, einmal mit Verdünnter. Wichtig für die rganisation ist, dass Sie sich 45 Minuten bevor Sie die Messung starten wollen bei den Assistenten melden, damit die HPLC-Anlage gespült und äquilibiert wird. Und bedenken Sie, dass die Messung spätestens 1 Stunde vor Ende des Praktikumstages gestartet werden muss. 1. Überprüfung der Anlage Vergewissern Sie sich, dass das Abfallgefäß leer ist und noch ausreichend Fließmittel zur Verfügung steht. Es sollten noch 500 ml Phosphatpuffer+10% Methanol und 300 ml Methanol, 300 ml Acetonitril und 300 ml HPLC- Wasser+10% Methanol vorhanden sein. Ist diese Menge unterschritten, melden Sie sich bitte im Assistentenzimmer, bzw. stellen Sie neuen Puffer und HPLC-Wasser+10% Methanol her. Es handelt sich um 0,05 M Phosphatpuffer+10% Methanol mit ph 7,0. Sie brauchen Kaliumdihydrogenphosphat, HPLC-Wasser (Assistentenzimmer), Methanol (p.a.) und KH zur Einstellung des ph-wertes. Zudem muss darauf geachtet werden, dass das Gläschen zur Hinterkolbenspülung mindesten ¾ mit Methanol (p.a.) gefüllt ist. 2. Probenvorbereitung: 2.1. Herstellung der Stammlösung Sie erhalten einen 25 ml-messkolben mit ca. 5 mg meprazol (die genaue Einwaage ist darauf vermerkt). Den Kolben füllen Sie mit einer 1:1-Mischung aus Wasser und Methanol (p.a.) unter zur Hilfenahme einer Eppendorf-Pipette auf eine Konzentration von 0,2 g/l auf. Schütteln Sie kräftig, bis sich das meprazol gelöst hat.
3 2.2. Herstellung der Verdünnungsreihe für die Kalibriergerade Dazu entnehmen Sie 2,5 ml aus der Stammlösung und überführen diese in einen leeren 5 ml-messkolben. Füllen Sie mit der Wasser- Methanol(p.a.)-Mischung auf 5 ml auf. (Schütteln nicht vergessen!) Aus dieser Lösung werden wieder 2,5 ml entnommen. Der Vorgang wird solange wiederholt, bis Sie vier Lösungen hergestellt haben, also vier Verdünnungsschritte Herstellung der Probenlösungen In vier 20 ml-messkolben füllen Sie je 5 ml aus der Stammlösung und fügen jeweils 2,5 ml 0,1 M HCl hinzu. (bzw. 0,001 M HCl in der zweiten Variante). Stoppen Sie die Zeit! Nach 5 Minuten wird die erste Reaktion angehalten, indem Sie 2,5 ml 0,1 M NaH (bzw. 0,001 M NaH) zugeben. In den anderen Messkolben stoppen Sie die Reaktion nach 15, 30 und 90 Minuten, jeweils wieder durch Zugabe von NaH. Schließlich geben Sie mit der Eppendorf-Pipette noch 5 ml Phosphatpuffer hinzu. Überführen Sie von jeder der 9 Lösungen etwa 0,5 ml in HPLC-Vials (muss nicht genau sein) und markieren Sie welche Lösung sich in welchem Vial befindet. Die Vials sind dann etwa zur Hälfte gefüllt und werden in das zum Gerät gehörige Rack wie folgt einsortiert: 1: Stammlösung 2: 1. Verdünnung 3: 2. Verdünnung 4: 3. Verdünnung 5: 4. Verdünnung 6: 5 min 7: 15 min 8: 30 min 9: 90 min 10: Vial mit Methanol (Wichtig! Muss immer an diesem Platz stehen,
4 zum spülen der Nadel) Die Sortierung ist wichtig, weil die Methode genau so programmiert ist und man seine Ergebnisse am Ende eindeutig wieder findet. 3. Messung: Wenn Sie mit der Probenvorbereitung fertig sind, melden Sie sich im Assistentenzimmer. Der HPLC-Lauf kann dann gestartet werden (vom Assistenten!). Die verwendete Säule ist eine LiChroCART von Merck mit einer LiChrospher 100RP18-Füllung (Partikelgröße 5 µm). Als mobile Phase wird eine Mischung aus Phosphatpuffer (+10% Methanol) ph 7,0 (0,05 M), Methanol und Acetonitril im Verhältnis 55,6:24,4:20 verwendet. (Die Mischung braucht nicht hergestellt zu werden, die Anlage besitzt einen Gradientenmischer.) Mit diesem Gemisch wird zunächst die Anlage gepurged und dann 30 Minuten bei einer Flussrate von 1 ml/min die Säule äquilibriert. Für die Trennung wird eine Flussrate von 1,2 ml/min eingestellt. Die Detektion erfolgt bei einer Wellenlänge von 280 nm. Der Lauf für die Proben der Kalibriergeraden dauert 6 Minuten, der für die Proben 40 Minuten. Sie sehen also, dass es durchaus entscheidend ist, dass Sie die Proben richtig in das Rack einsortieren. 4. Auswertung: Da die Messungen der Proben einige Stunden dauern, kann die Auswertung erst am nächsten Praktikumstag erfolgen. Bringen Sie einen USB-Stick mit. Sie erhalten die Chromatogramme mit den Wertetabellen in Form von PDF- Dateien. Gebrauchen Sie für die Auswertung ein geeignetes Programm für Tabellenkalkulation Erstellen Sie eine Kalibriergerade für die verschiedenen Nifedipin- Konzentrationen (mit Gleichung und Korrelationskoeffizient) Stellen Sie den Abbau von Nifedipin in einer geeigneten graphischen Form dar.
5 4.3. Formulieren Sie ein Ergebnis. Die Abgabe der Auswertung hat spätestens am zweiten Praktikumstag nach der Probenvorbereitung zu erfolgen. Geben Sie den Ausdruck ihrer Auswertung, versehen mit Namen und Datum, und die ausgedruckten Report-Files im Assistentenzimmer ab. Die Auswertung sollten Sie sicherheitshalber an diesem Tag auch in elektronischer Form auf dem USB-Stick dabeihaben. Rechnen Sie damit, dass Sie uns zeigen müssen, wie Sie die Diagramme erstellt haben.
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