In vivo Antigen-Beladung Antigen-präsentierender Zellen mit Hilfe von rekombinanten Fcy-Rezeptor-Antikörpern
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- Charlotte Baumann
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1 In vivo Antigen-Beladung Antigen-präsentierender Zellen mit Hilfe von rekombinanten Fcy-Rezeptor-Antikörpern Der naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Christian H.K. Lehmann aus Neuhaus am Rennweg
2 1 ZUSAMMENFASSUNG 15 2 SUMMARY 17 3 EINLEITUNG Dendritische Zellen Dendritische Zellen und die Balance zwischen Toleranz und Immunität T-Zellaktivierung durch Dendritische Zellen Die klassische Antigenprozessierung für die MHC-I-Präsentation Die klassische Antigenprozessierung für die MHC-Il-Präsentation Die Antigenprozessierung in Dendritischen Zellen Kreuzpräsentation - MHC-I-Präsentation extrazellulärer Proteine Autophagie - Prozessierung zytosolischer Proteine für die MHC-Il- Präsentation Stimulation naiver T-Zeilen durch Dendritische Zellen Weitere Mechanismen zur Steuerung der Immunantwort Die Heterogenität Dendritischer Zellen und deren Entwicklung in der Maus Subklassen Dendritischer Zellen Die Entwicklung Dendritischer Zellen Fcy-Rezeptoren Fcy-Rezeptoren - Diversität und Funktionen Fcy-Rezeptorexpressionsprofil Dendritische Zellen und Fcy-Rezeptoren Dendritische Zellen in der Medizin Monozyten-gereifte Dendritische Zellen Die in vivo Antigen-Beladung Zielsetzung 46 4 ERGEBNISSE Fcy-Rezeptar-Expression auf DCs unter nicht inflammatorischen Bedingungen Knochenmarks-gereifte Dendritische Zellen Lymphoide Organe Milz und Lymphknoten Knochenmark und Thymus Nicht Lymphoide Organe Lunge Klonierung und Expression chimärer Fcy-Rezeptor-Antikörper S'-Rapid Amplification ofcdna ends (5'RACE) Overlap-PCR Antikörperproduktion und Bindungs-Test In vivo Bindung, Endozytose von und DC-Aktivierung durch afcy- Rezeptor-Antikörper In vivo Bindung der rekombinanten Fcy-Rezeptor-Antikörper Endozytose von Chimären Fcy-Rezeptor-Antikörpern 68 XI
3 4.3.3 Die Aktivierung Dendritischer Zellen durch Chimäre Antikörperkonjugate In vivo Antigen-Beladung mit afcy-rezeptor-antikörpern CD4* und CD8* T-Zellantworten nach Fcy-Rezeptor-Antigen-Beladung Rezeptorspezifität der Antigen-Beladung über FcyRIlB und FcyRIV Antigen-Beladung nach Clodronat-Vesikel-Gabe Clodronat-Vesikel depletiert Monozyten und CDllc*CDS* DCs T-Zellantworten nach Clodronat-Vesikelgabe Antigen-Beladung in CDllc-DTR-Mäusen nach Diphtherietoxin-Gabe Diphtherie-Toxin depletiert CD 11c*** Zellen in CDllc-DTR-Mäusen T-Zellantworten nach Diphterietoxin-Gabe T-Zellantworten nach FcyRIlB-Antigen-Beladung in pdc-depletierten Tieren apdca-1 depletiert pdcs in C57BU6-Mäusen T-Zellantworten nach pdc-depletion T-Zellantworten nach FcyRIlB-Antigen-Beladung in pmt-mäusen T-Zellantworten in B-Zell-freien Tieren Antigen-Beladung von FcyRIV in Zelltyp-spezifischen knock out-tieren CDllc-Cre x FtyR/V* " *- und LysM-Cre x FcyRI\/ kua "-Mäuse ctfcyriv-antigen-beladung in zelltypspezifischen knock out-mäusen Ex vivo Analyse der verantwortlichen Zellpopulation Antigen-Beladung Dendritischer Zellen unter inflammatorischen Bedingungen In vivo Fcy-Rezeptor-Antigen-Beladung unter inflammatorischen Bedingungen acd40-costimulation in Wildtyp- und Fcyx FcyRIlB'*'-Mäusen Antigen-Beladung in Wildtyp- und FcyRUB, '-Tieren unter acd40- Costimulation Antigen-Beladung in C57BU63- und pmt* -Tieren unter ocd40- Costimulation Anedyse der fehlenden Reaktion auf acd40 in FcyRIlB^'-Mäusen CD40-Expression in C57BU6J-, Fcy''- und FcyRIlB 1 '-Mäusen In vivo Aktivierung von Immunzellen nach acd40-gabe T-Zellantworten in naiven Mäusen Ausblick DISKUSSION Fcy-Rezeptor Expression auf Dendritischen Zellen Generierung neuer afcy-rezeptor-antigenbeladungsantikörper In vivo Bindung, Endozytose von und Aktivierung durch afcy-rezeptor- Antikörper In vivo Antigen-Beladung mit afcy-rezeptor-antikörper-antigen- Konjugaten Ex vivo Analyse der Antigen-Präsentation durch verschiedene Zellpopulationen In vivo Antigen-Beladung mit afcy-rezeptor-antikörpern unter Costimulation Untersuchungen zur Rolle des FcyRIlB für die acd40-costimulation 137 XII '88
4 5.8 T-Zell-Antworten in naiven Mäusen METHODEN Zellkultur Verwendete Zelllinien Passagieren stabiler Zelllinien Einfrieren und Auftauen von Dauerzellkulturen Generation von DCs aus Knochenmarks-Monozyten Klonierung RNA-Präparation und Qualitätskontrolle PCR Agarose-Gelelektrophorese Gelextraktion und PCR-Purification RT-PCR und 5'RACE Blunt- und TA-Klonierung von PCR-Produkten in Topoisomerasevektoren Overtap-PC Rs Restriktionsverdaus Ligation Primer-Annealing Kompetente Bakterien Transformation Mini-Präparationen von Plasmid-DNA Maxi-Präparation von Plasmid-DNA Bestimmung von DNA-Konzentrationen Antikörper-Produktion Antikörperproduktion in ISF-1 (Zellkulturflasche/Einweg-Membran Bioreaktor) Transiente CaCl rtransfektion zur Antikörperproduktion Ammoniumsulfatfällung und Dialyse Antikörperaufreinigung über Protein-G-Beads SDS-Gelelektrophorese Coomassie-Fäftoung Antikörperkonzentrationsbestimmung (Bradford-Assay) LPS-Removal Endotoxin-Test Antikörpermarkierung Experimente in Mäusen Präparation von Einzelzellsuspensionen FACS-Färbung In vivo Antikörperbindung Endozytose-Assay Ex vivo Proliferations-Assay MACS-Anreicherung und -Abreicherung FACS-Sortierung 181 XIII
5 6.4.8 CFSE-Markierung In vivo Proliferations-Assays In vivo Zelldepletionen Depletion durch Diphtenetoxin (DT) ADCC Clodronat-Vesikel Restimulations-Assays VERZEICHNISSE Abkürzungsverzeichnis Verwendete Antikörper Literaturverzeichnis Abbildungsverzeichnis DANKSAGUNG 225 XIV
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