Wiebke Häger Molekulare Zellbiologie und Biomedizin (Seminar: Zelluläre Plastizität) WS 2012/2013

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1 Wiebke Häger Molekulare Zellbiologie und Biomedizin (Seminar: Zelluläre Plastizität) WS 2012/2013

2 Embryonale Stammzellen (ESC) Befruchtung, 2-, 4-, 8-Zellstadium, Morula, Blastula Embryoblast = innere Zellmasse (ICM) embryonale Stammzellen¹ pluripotent Gewinnung² aus überzähligen Embryonen von künstlichen Befruchtungen aus abgetriebenen Föten und Embryonen in Deutschland Embryonenschutzgesetz Abb.1

3 Pluripotente Zellen Zellen, die sich zu allen Zelltypen differenzieren können Fähigkeit der Selbsterneuerung Hoffnung in Forschung für Ersatz und Erneuerung von Zellen und Geweben bei Transplantationen Abb.2

4 Faktoren zur Aufrechterhaltung von Pluripotenz Transkriptionsfaktoren³: OCT4 SOX2 NANOG usw. wichtig bei reprogramming der Zellen induzierte pluripotente Stammzellen (ips) mirnas

5 micrornas (mirnas) kleine, nicht-kodierende RNA-Moleküle Länge: Nucleotide Bindung an nicht-kodierende Sequenzen in 3 UTR-Region spezifischer Ziel-mRNAs Behinderung der Translation oder Abbau der mrna⁴ an post-transkriptionaler Regulation zellulärer Prozesse beteiligt Expressionsmuster von mirnas charakteristisch für bestimmte Gewebetypen und Entwicklungsstadien von Zellen⁵ Abb.3

6 Differenzierung von ESCs häufig über embryoid bodies (EBs)⁶ ⁷ Zellkultur ohne Antidifferenzierungsfaktoren spontane Differenzierung von ESCs zu kugeligen Zellaggregaten: embryoid bodies Rekapitulation vieler Aspekte der Zelldifferenzierung der frühen Embryogenese durch Ebs Differenzierung zu Vorläuferzellen, z.b. neuronale Vorläuferzellen Abb.4

7 A regulatory circuitry comprised of mir-320 and the transcription factors OCT4 and NR2F2 regulates human embryonic stem cell differentiation Alessandro Rosa und Ali H. Brivanlou (Laborytory of Molecular Vertebrate Embryology, The Rockefeller University, New York, NY, USA)

8 Fragestellungen Welche Rolle spielen NR2F2, OCT4 und mir-302 bei der Pluripotenz bzw. Differenzierung von hescs? Wie wird NR2F2 reguliert? In welchen Zusammenhang stehen NR2F2, OCT4 und mir-302 bei der Regulation? Wo wird NR2F2 exprimiert? Welche Auswirkungen hat die NR2F2- Expression auf die Entwicklung von EBs?

9 Zellkultur und Differenzierungs-Assays 2D: adhärente Kulturen als Monolayer⁸ Zellkultur auf mit Matrigel beschichteten Platten conditioned Medium (CM) mit bfgf (basic fibroblast growth factor) Zellen bleiben in undifferenziertem, pluripotenten Stadium Induktion der Differenzierung durch Einsatz von Medium ohne bfgf (ncm) 3D: embryoid bodies (EB) Abb.5

10 Luciferase Assay Kopplung des Promotors des Gens von Interesse (Gen X) mit Luciferase-Gen Aktivierung des Promotors durch für Gen X spezifischen Aktivator Expression von Luciferase Umsatz von Luciferin zu Oxyluciferin durch Luciferase Chemoluminiszenz⁹ Abb.6

11 Chromatin-Immunopräzipitations (ChIP) Analyse in vivo Analyse der Bindung von Proteinen an DNA-Sequenzen Ablauf¹⁰ Fixierung der DNA-Protein-Bindung Zelllyse und DNA-Isolierung DNA-Fragmentierung Präzipitation der Proteine mit Antikörpern Identifikation der detektierten Fragmente (z.b. durch PCR) Abb.7

12 Wie verhalten sich OCT4, mir-302 und NR2F2 während der Differenzierung der hescs? Differenzierungs-Assay Pluripotenz: kein NR2F2 detektierbar hohe Level OCT4 und mir-302 zunehmende Differenzierung: Zunahme von NR2F2 Abnahme von OCT4 und mir-302 inverse Korrelation zwischen der Transkription von NR2F2 und der Expression von OCT4 und mir-302 während der Differenzierung von hescs Abb.8

13 Wie verhalten sich OCT4, mir-302 und NR2F2 während der Differenzierung der hescs? Besonderheit: Verzögerung von NR2F2- Expression hohe Transkript-Level schon 3-5 Tage vor Expression des Proteins vorhanden Verzögerung der Translation? Gibt es eine post-transkriptionelle Regulation von NR2F2?? Ist NR2F2 direktes mir-302-target? Abb.8

14 Ist NR2F2 ein direktes Target von mir-302? Zelllinie, bei der sowohl NR2F2 als auch mir-302 nicht exprimiert werden Transfektion mit NR2F2 NR2F2 + mir-302 NR2F2 + mir-co (Kontrolle) mit mir-302: starke Abnahme von NR2F2 mit mir-co: keine Veränderung der NR2F2- Expression Abb.9 unterstützt die Vermutung, dass mir-302 die Expression von NR2F2 reprimiert? Ist eine Bindungsstelle von mir-302 an NR2F2-mRNA vorhanden?

15 Ist NR2F2 ein direktes Target von mir-302? TargetScan: zwei mögliche Bindungsstellen von mir-302 auf NR2F2-mRNA Luciferase Assay: Kopplung von Luciferase mit Varianten vom 3 UTR von NR2F2 Transfektion der Zellen mit Konstrukt und mir-302 WT: kaum Expression von NR2F2 Mut1 und Mut2: wenig Expression von NR2F2 Mut1+2: Expression von NR2F2 mit nur sehr geringer Repression Abb.10 Abb.11

16 Ist NR2F2 ein direktes Target von mir-302? NR2F2 ist direktes Target von mir-302 beide Bindungsstellen von NR2F2 tragen zur negativen Regulation durch mir-302 bei Abb.10

17 Welche Transkriptionsfaktoren beeinflussen die Expression von NR2F2? Map der genomischen Regionen in hescs, an die Transkriptionsfaktoren binden, vorhanden in der Nähe vom NR2F2-Locus Bindestelle für OCT4 vorhanden keine Bindestelle für SOX2 oder NANOG? Wie beeinflusst OCT4 die Expression von NR2F2?

18 Welche Rolle spielt OCT4 bei der Expression von NR2F2? RNAi mit anti-oct4 sirna OCT4-mRNA und Protein inhibiert Inhibition von SOX2 und NANOG Anstieg von NR2F2 mrna andere bekannte frühe Differenzierungsgene Sox1, Brachyury nicht aktiv direkter Zusammenhang zwischen OCT4 und NR2F2 Abb.12 Western Blot: nur geringer Anstieg von NR2F2-Protein verglichen mit Transkript post-transkriptionale Inhibition durch mir- 302 Abb.13

19 Welche Rolle spielt OCT4 der der Expression von NR2F2? ChIP: Untersuchung der Bindung von OCT4 in vivo in undifferenzierten Zellen Anreicherung in OCT4 und mir-302 Promotorregionen und am NR2F2- Locus keine Bindung von OCT4 vom Promotor: Transkription von NR2F2 transkriptionelle Repression von NR2F2 durch OCT4 gleichzeitig Aktivierung von mir-302 durch OCT4 posttranskriptionale Unterdrückung von NR2F2 OCT4 reprimiert NR2F2 und aktiviert mir-302

20 Regulatorischer Schaltkreis aus mir-302 und den Transkriptionsfaktoren OCT4 und NR2F2 Abb.14

21 Regulatorischer Schaltkreis aus mir-302 und den Transkriptionsfaktoren OCT4 und NR2F2 Inhibition von NR2F2: auf transkriptionaler Ebene durch OCT4 post-transkriptional durch mir-302 gegenseitige Regulation von OCT4, NR2F2 und mir-302 Abb.14 mir-302 verantwortlich für Feinabstimmungen zwischen OCT4 und NR2F2 Puffer für Schwankungen im OCT4-Level

22 Regulatorischer Schaltkreis aus mir-302 und den Transkriptionsfaktoren OCT4 und NR2F2 Abb.14

23 Welche Rolle spielt NR2F2 bei der Differenzierung von hescs? Immunfärbung Pluripotenz: positiv für OCT4, negativ für NR2F2 Differenzierung: starke Abnahme von OCT4, nach ca. 7 Tagen NR2F2-positive Zellen charakteristisch für Neuralrosette : Expression von frühen neuralen Markern z.b. Pax6 Abb.15 Expression von NR2F2 in neuroectodermalen Geweben, die sich aus hesc entwickeln

24 Welche Rolle spielt NR2F2 bei der Differenzierung von hescs? Analyse der Genexpression bei EB-Entwicklung in N2M-Medium NR2F2 exprimiert, sobald die Zelle anfängt sich zu differenzieren große Überschneidung mit Expressionsmuster von Pax6 Abb.16? Sind Pax6 und NR2F2 gleichzeitig in den gleichen Zellen vorhanden? Zusammenhang zwischen beiden?

25 Welche Rolle spielt NR2F2 bei der Differenzierung von hescs? Immunfärbung: Überlappung bei der frühen Differenzierung (Tag 8-10) Abb.17 lässt vermuten, dass NR2F2 eine Rolle bei der frühen Differenzierung während der Neurogenese spielt

26 Was macht NR2F2 bei der frühen Neurogenese? loss of function Analyse (RNAi) Gene, die vom NR2F2-Abbau betroffen sind: frühste neurale Marker, z.b. Pax6 nicht betroffen: spätere neurale Marker, z.b. Sox1 Überexpressions-Assay: Abnahme von OCT4 in Zellen zusätzlich Anzeichen von Differenzierung, obwohl unter Pluripotenzbedigungen in conditioned Medium gehalten Abb.18 mehr frühe neroectodermale Gene exprimiert lässt Funktion von NR2F2 bei der Bildung des frühen anterioren Neuroectoderm vermuten Abb.19

27 Zusammenfassung Regulatorischer Schaltkreis aus mir-302 und den Transkriptionsfaktoren OCT4 und NR2F2 Abb.14

28 NR2F2 ist entscheidend beim Übergang von Pluripotenz zu Differenzierung spielt eine wichtige Rolle bei der Expression von Pax6 und anderen neuralen Genen, die für die Differenzierung in Neuroectoderm nötig sind verbindet den Übergang von pluripotenten Zellen mit der gerichteten spezifischen Differenzierung in eine bestimmte Richtung entscheidend für Schicksal der Zelle

29 Vielen Dank für eure Aufmerksamkeit!

30 Quellen 1) Khoo et al. Biol Reprod Dec;73(6): ) 3) Hu et al. Stem Cells Nov 8. [Epub ahead of print] 4) Lehninger, Nelson, Cox: Lehninger Biochemie. 4. Auflage. Springer-Lehrbuch, Berlin ) Osaki et al. Biomarkers Nov;13(7): ) Khoo et al. Biol Reprod Dec;73(6): ) Kurosawa et al. J Biosci Bioeng May;103(5): ) =SELECT&form=formTree_catBean&size=20 9) umineszenz.vlu/page/vsc/de/ch/8/bc/biokatalyse/luci_assay.vscml.html 10) Services/Applications/epigenetics-noncoding-rna-research/Chromatin- Remodeling/Chromatin-Immunoprecipitation-ChIP.html Rosa et al. EMBO J Jan 19;30(2):

31 Abbildungen 1) 2) 3) Lehninger, Nelson, Cox: Lehninger Biochemie. 4. Auflage. Springer-Lehrbuch, Berlin ) Khoo et al. Biol Reprod Dec;73(6): ) 6) umineszenz.vlu/page/vsc/de/ch/8/bc/biokatalyse/luci_assay.vscml.html 7) ) Rosa et al. EMBO J Jan 19;30(2):

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