Ein Blick in die Zukunft, Entwicklung neuer Testverfahren zum Nachweis von Salmonellen und Campylobacter. Dr. Janin Stratmann-Selke

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1 Ein Blick in die Zukunft, Entwicklung neuer Testverfahren zum Nachweis von Salmonellen und Campylobacter Dr. Janin Stratmann-Selke

2 Salmonellen und Campylobacter als Erreger von Lebensmittelinfektionen Salmonellen Campylobacter Salmonellen und Campylobacter stellen die Spitzenreiter unter den bakteriellen Erregern von Lebensmittelinfektionen beim Menschen dar alle infizierten Nutztierarten können Keimträger sein ohne klinische Erscheinungen zu zeigen nach Infektion durch Konsum erregerhaltiger Lebensmittel kann es beim Menschen, abhängig vom Alter und Immunstatus, zu schweren Durchfallerkrankungen kommen

3 Salmonellen und Campylobacter als Erreger von Lebensmittelinfektionen Eintrag von Erregern in Lebensmittel und somit Reduktion von Lebensmittelinfektionen kann nur durch eine optimale Diagnostik erzielt werden - vorbeugender Verbraucherschutz und Qualitätssicherung

4 ...die hier vorgestellten Arbeiten sind Teile des Projekts Phage Display basierte Verfahren zum direkten und indirekten Nachweis von Salmonella und Campylobacter species im Schwein In Kooperation mit der Technischen Universität Braunschweig und der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, gefördert aus Mitteln des Bundesministeriums für Bildung und Forschung im Rahmen des BioProfil Projektes Funktionelle Genomanalyse Identifizierung immunogener und oberflächenassozierter Antigene Isolierung von rekombinanten Antikörpern und Peptiden mittels Phage Display Peptid-Capture PCR zum Nachweis von Salmonellen avisierte Produkte sowie von Campylobacter jejuni und C. coli in Kot und Gülle Kompetitive ELISA zum Nachweis von Antikörpern gegen Salmonellen sowie gegen C. jejuni und C. coli in Serum und Fleischsaft

5 Entwicklung neuer Testsysteme zum indirekten Erregernachweis (ELISA) die zur Zeit verwendeten Testsysteme zum serologischen (indirekten) Nachweis von Salmonellen basieren auf LPS als Test-Antigen (Lipopolysaccharid der äußeren Membran) wenig definiertes Antigen Kreuzreaktionen falsch positive Ergebnisse, vor allem bei älteren Tieren es gibt bis dato kein kommerziell erhältliches Testsystem für den serologischen Nachweis von Campylobacter bei Nutztieren Etablierung neuer Testverfahren, basierend auf definierten Antigenen Etablierung tierartübergreifender Testsysteme - kompetitiver ELISA

6 Schritt für Schritt zum neuen Test Auswahl des geeigneten Antigens Identifizierung spezifischer Antigene über vergleichende Proteomanalyse mittels 2-dimensionaler Gelektrophorese GKNNHTRAAQ QCWKPNSSNN QRHPWQQGG TTCHQKARKL RRQWRAHHCS SLKAPTWKHQ WR... Kultivierung des Erregers Präparation der Oberflächenproteine (potentielle Antigene) Darstellung der Oberflächenproteine - nach Vergleich Auswahl potentieller Antigene Identifikation über Sequenzierung

7 Schritt für Schritt zum neuen Test Herstellung des ausgewählten Antigens Über die Sequenzierung ist ein Rückschluss auf das Antigen codierende Gen möglich dies kann dann in ein Expressionssystem eingefügt werden und so rekombinant durch E. coli exprimiert werden anschließend erfolgt die Aufreinigung und der Einsatz als Testantigen MGKNNHTRAAQQC WKPNSSNNQRHPW QQGGTTCHQKARKL RRQWRAHHCSSLKA PTWKHQWR... Proteinsequenz ATGGGTAAAAATAATCATACT CGTGCTGCTCAACAATGTTG GAAACCTAATTCTTCTAATAA TCAACGTCATCCTTGGCAACA AGGTGGTACTACTTGTCATCA AAAAGCTCGTAAACTTCGTC GTCAATGGCGTGCTCATCATT GTTCTTCTCTTAAAGCTCCTA CTTGGAAACATCAA... codierendes Gen Einschleusen des Gens in E. coli und Expression des Antigens

8 Schritt für Schritt zum neuen Test Eignungsprüfung des rekombinant hergestellten Antigens das rekombinante Antigen wird auf ELISA Platten gecoatet und mit verschiedenen Kontrollseren, sowie mit Patientenseren auf seine Eignung als Testantigen zum indirekten Erregernachweis überprüft nur infektionsrelevante, immunogene und spezifische Proteine eignen sich als Antigene ist diese Entwicklungsphase positiv abgeschlossen, so schließt sich für einen tierartspezifischen Test die Validierung an für einen tierartübergreifenden Test, sowie für höchste Sensitivität & Spezifität des Tests wird anschließend ein kompetitiver ELISA etabliert die gemessene Farbintensität ist direkt proportional zur Antikörperaktivität des Patientenserums

9 Schritt für Schritt zum neuen Test Etablierung eines kompetitiven ELISA für einen kompetitiven ELISA benötigt man zusätzlich einen Antikörper, der monospezifisch für das Antigen ist einen monospezifischen Antikörper kann man z.b. über Antikörper- Phage Display isolieren dieser konkurriert mit den Antikörpern in der Probe um die Bindung an das Antigen bei einem hohen Antikörpergehalt in der Probe wird der zweite Antikörper verdrängt da man die Bindung des monospezifischen Antikörpers nachweist, kann das Testsystem tierartübergreifend zum indirekten Erregernachweis genutzt werden

10 Schritt für Schritt zum neuen Test... positives Patientenserum negatives Patientenserum die Antigen-Bindungsstellen werden über die im Serum enthaltenen Antikörper besetzt der markierte Detektionsantikörper findet keinen Bindungspartner die Differenz der Farbintensität zwischen Eichkurve und getestetem Serum ist direkt proportional zur Antikörperaktivität kein Farbumschlag die Antigen-Bindungsstellen bleiben frei und der kompetitive monospezifische Antikörper bindet der markierte Detektionsantikörper kann binden es kommt zum Farbumschlag monospezifischer Antikörper Serum-Antikörper markierter Detektionsantikörper

11 ... der neue Test ein kompetitiver Test ermöglicht die (indirekte) tierartübergreifende Diagnose relevanter Erreger dies spielt vor allem bei Zoonoseerregern wie Campylobacter und Salmonellen eine wichtige Rolle in Hinsicht auf den vorbeugenden und nachhaltigen Verbraucherschutz sowie die Qualitätssicherung von Lebensmitteln tierischen Ursprungs eine sichere Diagnostik führt zur Reduktion von Lebensmittelinfektionen beim Menschen durch Verminderung des Erregereintrags in Lebensmittel tierischen Ursprungs

12 die Entwicklung neuer Testverfahren wird gefördert von: sie findet statt in Kooperation mit:

13 Schritt für Schritt zum neuen Test vielen Dank für ihre Aufmerksamkeit...