Prostaglandinstoffwechsel in Trypanosoma brucei: Klonierung und Charakterisierung der Prostaglandin F 2a Synthase und der PGD 2 induzierte Zelltod

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1 Prostaglandinstoffwechsel in Trypanosoma brucei: Klonierung und Charakterisierung der Prostaglandin F 2a Synthase und der PGD 2 induzierte Zelltod DISSERTATION der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Eberhard-Karls-Universität Tübingen zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften 2004 vorgelegt von Marc Rawer

2 INHALTSVERZEICHNIS EINLEITUNG Medizinische Bedeutung der Trypanosomen Biologie der Trypanosomen Systematische Stellung Entwicklungszyklus Zellmorphologie Biochemische Besonderheiten Zellzyklus, Differenzierung und Apoptose Zellzyklus und Differenzierung Apoptose und programmierter Zelltod in höheren Eukaryonten Apoptose und programmierter Zelltod bei Trypanosomen und anderen Einzellern Prostaglandine und ihr Stoffwechsel Freisetzung von Arachidonsäure Biosynthese von Prostaglandinen NSAIDs (Non Steroidal Anti-Inßammational Drugs) Ausgewählte Prostaglandine und ihre Wirkung Zielsetzung der Arbeit MATERIAL UND METHODEN Verwendete Organismen Verwendete Trypanosomen Versuchstiere Bakterien Materialien Chemikalien Enzyme Verwendete Antikörper Kits ,

3 Stammlösungen der eingesetzten Inhibitoren und Substanzen Verbrauchsmaterialien Geräte Medien, Puffer und Lösungen Kulturmedien für Trypanosomen Dünnschichtchromatographie SDS-PAGE: Herstellung und Färbungen Western Blot TUNEL-Färbung Immun fluoreszenz Elektronenmikroskopie Immunisierung und IgY-Isolierung Pyruvatbestimmung Molekularbiologische Arbeiten Northern-Blot-Lösungen RNA-Isolation Primer Methoden der Kultivierung In vivo Anzucht und Isolierung der Blutformen von Trypanosoma brucei Anlegen von Stabilaten zur Infektion Sterile Isolierung von Trypanosomen Anlegen von Blutform-Kulturstabilaten Axenische Kultur von Blutformen des Stammes 221 In vitro Kultivierung der procyklische Form von Trypanosoma brucei Transformation zur procylische Form von Trypanosoma brucei Anlegen von Stabilaten aus in vitro Kulturen Immunisierung und Antikörperisolierung Immunisierune

4 2.5.2 Isolierung der polyklonalen Antikörper aus Hühnereiweiß Nachweismethoden Hemmtests und Inkubation mit verschiedenen Substanzen Pyruvat-Bestimmung In situ Cell Death Detection Kit von RÖCHE (TUNEL-Test) Propidiumjodid-Kernfärbung und FACS-Analyse Dihydrorodamin-Färbung und FACS-Anaylse VAD-CHO-Aktivitätsassay und FACS-Analyse Dünnschichtchromatographie (DC) Morphologische Untersuchungen im Lichrmikroskop Immunfluoreszenz Elektronenmikroskopische Methoden PAGE und Western Blot Methoden der Molekularbiologie Standard-PCR-Ansatz mit REDTaq DNA Polymerase Standard-PCR-Ansatz mit Pfu Turbo DNA Polymerase Standard-PCR-Programm DNA-Fällung (Kaliumacetat-Methode) Isolierung von Plasmid-DNA (pdna) aus E. coli durch alkalische Lyse (Mini-Prep) Isolierung von DNA und RNA Klonierung in pbluescript KS*-Vektor Northern Blot, ERGEBNISSE Axenische Kultivierung von Blutform-Trypanosomen Bestimmung von intrazellulären und extrazellulären Prostaglandinkonzentrationen Kultivierung von Trypanosomen in Anwesenheit verschiedener NSAIDs und von ETYA Klonierung der Prostaglandin F 2o Synthase (PGFS) 94

5 , Ahgnment mit anderen Mitgliedern der AKR-Familie Nachweis der PGFS in der Immunfluoreszenz, Western und Northern Blot Herstellung von polyklonalen AK gegen PGFS Immunfluoreszenz-Färbung der PGFS in Trypanosoma brucei Western Blot-Analyse der PGFS Northern 5/o/-Analyse der PGFS-Expression Wachstumsinhibition von Blutformen durch PGD 2 Analyse der Metabolite von PGD 2 und anderen Prostaglandinen Inkubation von Blutformen mit Derivaten des PGD 2 Analyse des durch PGD 2 induzierten Zelltodes EM-Analyse von PGD 2 behandelten Zellen (REM & TEM) Messung der DNA-Degradation mit TUNEL-Test und FACS-Analyse Fragmentierungsanalyse mit Hilfe eines DNA-Gel Nachweis von aktiven Sauerstoffspezies mit DHR Coinkubation von Trypanosomen mit PGD 2 und Caspase-Inhibitoren Behandlung von Trypanosomen mit Apoptoseinduktoren Coinkubation von Trypanosomen mit PGD 2 und second messenger Substanzen Charakterisierung des Pyruvatstoffwechsels bei PG-Behandlung DISKUSSION Produktion und Sekretion von Prostaglandinen durch Trypanosoma brucei Die PGF 2a -Synthetase aus Trypanosoma brucei Der PGD 2 -induzierte Zelltod von Trypanosoma brucei Ausblick ZUSAMMENFASSUNG LITERATURVERZEICHNIS ANHANG

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