Wulf-Iwo Bock THÜRINGER LANDESAMT FÜR LEBENSMITTELSICHERHEIT UND VERBRAUCHERSCHUTZ (TLLV)

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1 BVDV-Diagnostik im TLLV Wulf-Iwo Bock THÜRINGER LANDESAMT FÜR LEBENSMITTELSICHERHEIT UND VERBRAUCHERSCHUTZ (TLLV) BVD-Workshop, , TLLV Bad Langensalza

2 Was dürfen Sie erwarten BVDV-Diagnostik im TLLV BVDV-Untersuchungen in Thüringen Was bringt uns die Zukunft??? BVD-Workshop, , TLLV Bad Langensalza Folie 2

3 Unser Untersuchungsmaterial Direkter Erregernachweis (Virus- bzw. Genomnachweis) Organmaterial (Sektion), Hautbioptate (Ohrstanze) EDTA-Blut (Plasma), Serum Sperma Indirekter Erregernachweis (Antikörpernachweis) Serum, Plasma, Milch BVD-Workshop, , TLLV Bad Langensalza Folie 3

4 BVDV Diagnostikspektrum am TLLV Direkter Erregernachweis (Virus- bzw. Genomnachweis) Anzüchtung auf Zell-Linien 1. Virusidentifikation durch spezif. Antikörper (IFT und NPLA) 2. Genomnachweis mittels qrt-pcr Genomnachweis (qrt-pcr) Standardverfahren- 1. panpesti-qrt-pcr 2. Differenzierung BVDV 1 & 2, Border disease, Schweinepest (Antigen-ELISA) Weitere Untersuchungen (Genotypisierung) können im Nationalen Referenzlabor für BVD/MD am Friedrich-Loeffler-Institut (Insel Riems) durchgeführt werden. Indirekter Erregernachweis (Antikörpernachweis) ELISA BVD-Workshop, , TLLV Bad Langensalza Folie 4

5 Direkter Erregernachweis I (Virusanzüchtung) Ziel: Weg: Prinzip: Virusvermehrung wiederholte Passagen in der Zellkultur natürliche Vermehrung des Virus in den Zellen, mit anschließendem spezifischen Nachweis (spezif. Antikörper, PCR) Vorteile: Nachteile: komplettes vermehrungsfähiges Virus (weiterführende Bearbeitung (Impfstoffentwicklung) ist möglich) relativ lange Dauer (2-3 Wochen), wenig sensitiv, BVD-Workshop, , TLLV Bad Langensalza Folie 5

6 Direkter Erregernachweis II (quantitative PCR) Ziel: Weg: Prinzip: Vorteile: Nachteile: Nachweis des Virus Genoms mit Ermittlung der Kopienzahl Real-Time (RT-)PCR z. B. Applied Biosystems (SDS 7500) Standardverfahren- Fluoreszenzdetektion während der PCR ( realtime ) Einsatz eines Standards zur Quantifizierung schnell, sensitiv, quantifizierbar, Poolansätze (Blut bis 50 Proben) Kosten relativ hoch Standard zur Quantifizierung Kopien/5µl 10 Kopien/5µl BVD-Workshop, , TLLV Bad Langensalza Folie 6

7 Indirekter Erregernachweis (ELISA) Ziel: Nachweis von BVD-spezifischen Antikörpern indirekter Nachweis einer BVD-Infektion oder Impfung Weg: Prinzip: Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) Antigen-Antikörper-Reaktion, mittels eines gekoppelten Enzyms wird ein Substrat umgesetzt Farbreaktion Vorteile: schnell, sensitiv, kostengünstig Nachteile: keine Aussage zu aktuellem Infektionsstatus, eine Unterscheidung Infektion oder Impfung ist nicht möglich Quelle: BVD-Workshop, , TLLV Bad Langensalza Folie 7

8 BVDV-Untersuchungen in Thüringen I Organmaterial (Virus) EDTA-Blut (AK + Virus) Gewebe/Ohrstanzen (Virus) AntiKörpernachweis Genom-/Virusnachweis ELISA Virusanzüchtung (Zellkultur) Antigen-Ag-ELISA (bis 2007) qrt-pcr (seit 2006) BVD-Workshop, , TLLV Bad Langensalza Folie 8

9 BVDV-Untersuchungen in Thüringen II Pool = Negativ (alle enthaltenen Proben sind Negativ) Negatives Einzeltierergebnis NegativPool = Positiv EDTA-Blut Ohrstanzen Poolung: Blut bis 50 Proben, Ohrstanzen 10 bis 25 Proben POOL-POSITIV Negative Einzelergebnisse Bestätigung durch NegativPool Wiederholung der Einzeluntersuchungen NegativPool = Negativ Negatives Einzeltierergebnis Poolauflösung (Kleinerer Pool bis Einzelprobe; ) POSITIVes Einzelergebnis POSITIV = Bestätigung Positives Einzeltierergebnis (Wiederholung der positiven Probe aus Originalmaterial) Negativ Wiederholung der Einzeluntersuchungen BVD-Workshop, , TLLV Bad Langensalza Folie 9

10 BVDV-Untersuchungen in Thüringen III (PI-Tiere) Verordnung zum Schutz der Rinder vor einer Infektion mit dem Bovinen Virusdiarrhoe-Virus (BVDV-Verordnung) vom 11. Dezember 2008, Bundesgesetzblatt Jahrgang 2008 Teil I Nr. 59, S.2461 vom 18. Dezember Begriffsbestimmungen persistent BVDV-infiziertes Rind: ein Rind, das mit einer in der amtlichen Methodensammlung beschriebenen Methode mit positivem Ergebnis auf BVDV untersucht worden ist und a) das längstens 60 Tage nach der ersten Untersuchung erneut mit einer in der amtlichen Methodensammlung beschriebenen Methode mit positivem Ergebnis auf BVDV untersucht worden ist, b) bei dem eine Wiederholungsuntersuchung nach Buchstabe a unterblieben ist oder c) das an Mucosal Disease erkrankt ist, sowie die Nachkommen eines Rindes nach den Buchstaben a bis c. BVD-Workshop, , TLLV Bad Langensalza Folie 10

11 BVDV-Untersuchungen in Thüringen IV (HI-Tier) Negativer Befund Negatives Einzeltierergebnis Positiver (1.) Befund Wiedereinsendung nach >42 Tagen Negatives Einzeltierergebnis (nicht PI-Tier) Positives Einzeltierergebnis (PI-Tier, laut BVDV-Verordnung) (Wiedereinsendung nach 42 Tagen, hohe Viruslast) Ohne Nachuntersuchung (PI-Tier, laut BVDV-VO) BVD-Workshop, , TLLV Bad Langensalza Folie 11

12 BVDV-Untersuchungen in Thüringen III Bedingt durch strukturelle Veränderungen im TLLV (Einstandortvariante in Bad Langensalza) und in der Thüringer Tierseuchenkasse, werden seit April 2006 die BVD-Genomnachweise im Rahmen der freiwilligen BVD- Bekämpfung in Thüringen am TLLV durchgeführt. BVD-Untersuchungen in Thüringen (2005 bis 2009) Antikörpernachweis Virusnachweise (*seit 2006 qrt-pcr) * BVD-Workshop, , TLLV Bad Langensalza Folie 12

13 BVDV-Untersuchungen in Thüringen IV gesamt positiv % verdächtig negativ n. a. (nicht auswertbar) 2005 ELISA (Antikörper) , AG-ELISA (Antigen) , Zellkultur , ELISA (Antikörper) , AG-ELISA (Antigen) , PCR , ELISA (Antikörper) , AG-ELISA (Antigen) , PCR , ELISA , PCR , ELISA , PCR , davon Ohrstanzen , (bis ) ELISA , PCR , davon Ohrstanzen , BVD-Workshop, , TLLV Bad Langensalza Folie 13

14 BVDV-Ohrstanz-Untersuchungen in Thüringen I BVD-Ohrstanzdiagnostik - Pilotstudie Thüringen ( ) Ziele: Etablierung, Training und Validierung der BVDV-Ohrstanzdiagnostik im Labor des TLLV Training des Handlings des Einziehens von Gewebe-OM Vorbereitung der BVD-Bekämpfung gemäß BVDV-Verordnung (Start: ) Anforderungen an das Ohrstanzsystem aus Laborsicht: Einfache und sichere Handhabung beim Einziehen der Ohrmarke und der Probengewinnung, um damit eine möglichst 100%ige Zuverlässigkeit bei der Probengewinnung zu erzielen Möglichkeit zur direkten Begutachtung der Probe Ausschluss falsch negativer Ergebnisse (Lebenslanger Befund mit nur einer Untersuchung) Maschinenlesbarer Barcode auf dem Probengefäß, welcher der Tierkennzeichnung entspricht Nachvollziehbarkeit der Probenidentität, Kompatibilität zu LIMS Der Weg: eine Erzeugerkette (6 Betriebe) und 1 Einzelbetrieb (geplant ca Tiere) Ohrmarkenhersteller Fa. Caisley alle Kälber werden in der ersten Lebenswoche mit 2 Gewebestanzen beprobt, die Blutprobenahme erfolgt nach dem 40. LT und dient als amtliches Ergebnis BVD-Workshop, , TLLV Bad Langensalza Folie 14

15 BVDV-Ohrstanz-Untersuchungen in Thüringen II BVD-Ohrstanzdiagnostik - Pilotstudie Thüringen ( ) Zwischenbilanz (Stand 14. Dezember 2009): Es wurde nur jeweils eine Ohrstanze untersucht (ges Proben), als Einzelprobe nach Lyse mit in-house-pcr (beta-actin als interne Kontrolle für Nukleinsäureextraktion und PCR) und als max. 10-er Pool mit einer zugelassenen BVD-Pool-PCR (interne Kontrolle nur f. PCR) Die Untersuchung der Rückstellprobe mit Nukleinsäureextraktion und/oder Vergleichssystem noch offen 1036 negativ, 6 positiv, 11 verdächtig, 56 nicht auswertbar!!! (keine IC, kein Material, defektes Gefäß) Dauer d. Untersuchungen im Rahmen der Studie im Schnitt ca. 3-4 Werktage ( 2 PCR s ) Dauer der Ergebnisübermittlung/Befundung teilweise bis zu 5 Wochen nach Probenahme Kritikpunkte: Probenbeurteilung, Qualität und Quantität der Gewebestanze Ausschlusskriterium eingesandte Gefäße teils defekt, nicht verschlossen, leer, unvollständig (weiß/gelb) Zuordnung im LIMS, Ergebnisübermittlung/Befundung (Schnittstellen) schnelle einfache Gewebe-Lyse führt zu einer verringerten Nukleinsäuereausbeute / -qualität für die PCR-Untersuchung (Faktor 1:1000 bis 1:10000 für die Einzelprobe) transiente Infektionen werden nicht erkannt (PI-Tiere ggf. auch nicht (zusätzlich noch Poolung!!!)???)??? Falsch negative Tier??? BVD-Workshop, , TLLV Bad Langensalza Folie 15

16 BVDV-Ohrstanz-Untersuchungen in Thüringen III BVD-Ohrstanzdiagnostik - Pilotstudie Thüringen ( ) Klärungsbedarf vor Einsatz als amtliche Untersuchung: Probenlogistik Untersuchungsantrag vs. Untersuchungsantragsfrei??? Anzahl der Untersuchungen 2010 & Probeneingang im TLLV nur schwer kalkulierbar!!! Anschaffung Gerätetechnik (abhängig von Ohrstanzsystem und der verwendeten PCR)??? Ergebnisübermittlung an Einsender/Landkreis vs. direkt in Hi-Tier oder auf OHR -Server??? Umgang mit dem Untersuchungsergebnis aus der Ohrstanzdiagnostik (Reicht schon das erste positive Ergebnis für den Status PI-Tier aus? Ist eine 2. Untersuchung aus Sicht der Tierseuchenbekämpfung (42 Tage PI-Tier im Bestand) gerechtfertigt/nötig?)??? Falsch negative Ergebnisse??? Schulung / Information der ATÄ + TÄ + Landwirte zur Probenahme/Lagerung/Versand??? BVD-Workshop, , TLLV Bad Langensalza Folie 16

17 Was bringt uns das Jahr 2010??? BVD-Diagnostik im Jahr 2010 Nachtreteruntersuchungen aller teilnehmenden Betriebe Ohrstanzproben in Mutterkuhherden ab 01.April 2010 Blutuntersuchungen alle anderen Betriebe Untersuchung von Beständen Zurückgestellte Betriebe aus dem Jahr 2009 (Anlage 7) Bestände mit einem aktuellen BVD-Problem in Abhängigkeit von den Untersuchungskapazitäten können eventuell weitere Bestände in der 2. Jahreshälfte untersucht werden BVD-Workshop, , TLLV Bad Langensalza Folie 17

18 Was bringt uns die Zukunft??? BVD-Diagnostik nach 2010 (aus heutiger Sicht) Nachtreteruntersuchungen Einsatz der Ohrstanzproben für alle Interessierten Blutuntersuchungen??? Wie viele Bestände haben ein aktuelles BVD-Problem??? BVD-Bekämpfung - QUO VADIS??? Sachsen Sachsen-Anhalt Thüringen Bayern Österreich & Schweiz??? BVD-Workshop, , TLLV Bad Langensalza Folie 18

19 BVDV-Diagnostik am TLLV Ich möchte eine BVD-Blutuntersuchung Was ist dabei zu beachten? EDTA-Blutprobe Vollständig aufgefüllter TLLV- Untersuchungsauftrag mit HI-Tier- Probenliste mit leserlichen Barcodes ( Bei Kälbern vom 8. bis 40. Lebenstag bitte ab sofort den Vermerk EINZELTIERUNTERSUCHUNG!!! (weitere Vermerke 0-7. LT bzw. >40. LT und Nachuntersuchungen sind wie bisher ausdrücklich erwünscht) BVD-Workshop, , TLLV Bad Langensalza Folie 19

20 Vielen Dank an die Kolleginnen und Kollegen in den VLÜÄ n, der Abteilung 2 des TLLV, den KollegInnen im Feld & dem NRL am Friedrich-Loeffler-Institut die gute Zusammenarbeit und für das Verständnis und vielen Dank an die fleißigen MitarbeiterInnen des Dezernates Infektionsdiagnostik und der Dezernate 51 und 53 BVD-Workshop, , TLLV Bad Langensalza Folie 20

21 Es gibt Menschen, die hinterlassen Spuren Spuren in den Herzen und Köpfen der Menschen, denen sie begegnen, und Spuren im Leben der Tiere, für die sie sich einsetzen. Petra Schnürch geboren am gestorben am Petras Leitspruch: Nicht weil es schwer ist, packen wir es nicht an, sondern weil wir es nicht einfach tun, erscheint es uns so kompliziert. BVD-Workshop, , TLLV Bad Langensalza Folie 21

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23 BVDV-Ohrstanzuntersuchungen 2010 Teil 1 BVD-Ohrstanzdiagnostik 2010 Start ab für Mutterkuhhaltungen Die Bestellung der Ohrstanz-Ohrmarken erfolgt normal über den TVL. Das Einziehen der OM muss innerhalb der ersten Lebenstage (bis spätestens 7. Lebenstag entsprechend den Vorgaben der ViehVerkV) erfolgen. Es werden aus beiden Ohren Stanzen entnommen, um Ausfälle (Nachuntersuchungen) durch Leerstanzen, beschädigte Gefäße und unzureichendes Probenmaterial u. a. zu minimieren. (Übergangsregelung!!!) Der Rinderhalter muss unverzüglich nach Kennzeichnung des Tieres die Geburtsmeldung an die Datenbank HI- Tier durchführen, um den Vorgaben der Viehverkehrsverordnung zu entsprechen und gleichzeitig eine sichere Zuordnung der Befunde zum Tier zu gewährleisten. Ohrstanzen können für etwa zwei Wochen gekühlt (2 bis 8 C) gelagert werden, so dass mehrere Stanzen gemeinsam versandt werden können. BVD-Workshop, , TLLV Bad Langensalza Folie 23

24 BVDV-Ohrstanzuntersuchungen 2010 Teil 2 Der Versand der Proben erfolgt über das Kuriersystem des Landes, in geeigneter doppelwandiger Verpackung (Tüte & Umverpackung aus z. B. Papier/Pappe) als antragsfreie Einsendung (kein Formular etc. nötig) an das Labor. Im antragslosen Verfahren eingesandte Proben werden vom Labor anhand der auf den Probengefäßen vorhandenen Ohrmarkennummern automatisiert identifiziert. Nach Probeneingang im Labor erfolgt umgehend die Bearbeitung, negative Ergebnisse liegen im Allgemeinen innerhalb von 4-5 Werktagen vor. mögliche Ergebnisse: Negativ = Nicht-PI-Tier Positiv = PI-Tier; sofortige Eliminierung aus dem Bestand nicht auswertbar (n. a.) = Nachuntersuchung mittels Blutprobe BVD-Workshop, , TLLV Bad Langensalza Folie 24

25 BVDV-Ohrstanzuntersuchungen 2010 Teil 3 Die Untersuchungsergebnisse werden dem jeweiligen Tier durch Übermittlung der Befunde in die HI-Tier Datenbank anhand der Ohrmarkennummer eindeutig zugeordnet, so dass das Tier sein Lebensergebnis erhält und entsprechend gehandelt werden kann. Tierhalter und Viehhändler mit eigenem Zugang zu HI-Tier können jederzeit die BVD-Befunde jedes Tieres aus der Datenbank abrufen (vor Verkäufen oder sonstigen Verbringungen), Tierhalter ohne HIT-Zugang wenden sich diesbezüglich bitte an ihr zuständiges Veterinäramt. Für die Ohrstanzen (Einziehen & Versand an Labor) gilt Je früher, desto besser Ansprechpartner, Labor: Herr W.-I. Bock Frau Dr. A. Mülverstedt BVD-Workshop, , TLLV Bad Langensalza Folie 25