Immunologische Methoden 31. Oktober 2013, Ruhr-Universität Bochum Karin Peters, karin.peters@rub.de
Agglutination von Antikörpern in Lösung Detektion von Antikörpern auf einer Matrix (ELISA, Western Blot, Immunfluoreszenz) Durchflusszytometrie und Zellsortierung (FACS) Detektion von zellulären Immunantworten
Charakterisierung von Antikörpern Spezifität: Erkennt der Antikörper nur ein spezifisches Epitop? Affinität: Avidität: Isotyp: Bindungsstärke eines Antikörpers an eine einzige Antigenbindungsstelle Gesamte Bindungsstärke mit mehr als einer Bindungsstelle IgG, IgM, IgE, IgA und IgD definiert durch die konstante Region des Antikörpers Idiotyp: Antikörper mit der gleichen Spezifität
Herstellung von Antikörpern: Eigenschaften des Antigens
Herstellung polyklonaler Antikörper Tag 1 14 24 35 45 56 70 Immunisierung mit 0,5mg Peptid konjugiert an KLH subcutan mit Freudschem Adjuvanz Blutentnahme
Herstellung monoklonaler Antikörper HGPRT=Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase HAT-Medium=Hypoxanthin, Aminpterin, Thymidin
HAT-Medium Aminopterin: Hypoxantin: Thymidin: blockiert den de novo Syntheseweg für Purine und Thymidin Abbauprodukt aus dem Purinstoffwechsel, kann über den salvage-pathway zur Purinsynthese eingesetzt werden mittels HPGRT muss zugeführt werden, da die Synthese durch Aminopterin blockiert ist
Heidelberger Präzipitationstest Prinzip: Die gleiche Menge Antikörper wird mit steigender Antigenkonzentration inkubiert
Immunpräzipitate Klinische Relevanz: Immunekomplexe lagern sich in Gefäßwänden und Organen ab z. B. Lupus erythematodes: Immunkomplexe lagern sich in den Glomeruli ab und aktivieren das Komplementsystem
Hämagglutination und Blutgruppenbestimmung
Coombs-Test
Agglutination von Antikörpern in Lösung Detektion von Antikörpern auf einer Matrix (ELISA, Western Blot, Immunfluoreszenz) Durchflusszytometrie und Zellsortierung (FACS) Detektion von zellulären Immunantworten
ELISA = Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay
Indirekter ELISA 1) Beschichtung mit dem Antigen Blockierung freier Bindungsstellen 2) Bindung eines spezifischen Antikörpers 3) Bindung eines enzymgekoppelten Zweitantikörpers 4) Substrat Farbiges Produkt 5) Messung der Absorbtion
Beispiel 1: Detektion von Allergen spezifischem IgE Alkalische Phosphatase Substrat: BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat) + NBT (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid) Antigen (Spezifisches Allergen) + Serum-IgE + Detektionsantikörper (IgG-Anti-IgE) + Substrat
Beispiel 2: Messung von IgE mittels Sandwich ELISA Alkalische Phosphatase Substrat: BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat) + NBT (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid) Fänger-Antikörper (IgG-Anti-IgE) + Serum-IgE + Detektionsantikörper (IgG-Anti-IgE) + Substrat
Kompetitions-ELISA
Western Blot (Immunoblot)
H.R. Gelderblom Robert-Koch-Institut, Berlin HIV-Nachweis durch Western Blot
Nachweis von Antikörperreaktionen durch Luminiszenz HRP: horseradish peroxidase Western-Blot
Fluoreszenz λ=488 nm Laser Fluorochrome Antibody λ=530 nm Emission Photodetector Fluorochromes Excitation (nm) Emission (nm)
Immunfluoreszenz Nachweis von Antigenen auf Zellen oder Gewebe mittels Antikörpern, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sind Macrophagen (grün) in der roten Pulp der Milz
Wofür wird die Immunfluoreszenz verwendet? In der Medizin: Nachweis von Autoantikörpern In der Biologie: Nachweis bestimmter Zelltypen im Gewebe Lokalisation von Proteinen in der Zelle
Agglutination von Antikörpern in Lösung Detektion von Antikörpern auf einer Matrix (ELISA, Western Blot, Immunfluoreszenz) Durchflusszytometrie und Zellsortierung (FACS) Detektion von zellulären Immunantworten
Isolierung mononukleärer Zellen (Ficoll-Hypaque-Gradientenzentrifugation) Verdünntes Blut Ficoll (Density = 1,078) Zentrifugation Thrombozyten Mononukleäre Zellen des peripheren Bluts (PBMC) Erythrozyten Granulozyten Zellkultur in vitro
Durchflusszytometrie
Zelluläre Parameter Laser (488 nm) Forward scatter (FSC) Cell size Side scatter (SSC) granularity
Messung der Lichtstreuung 1) Größe: Die Stärke des Vorwärtsstreulichts (FSC) ist proportional zur Zellgröe. 2) Granularität: Zellen ohne Granula induzieren nur geringes Seitwärtsstreulicht (SSC)
Messung der Lichtstreuung Das gemessene FSC und SSC wird für jede Zelle in einem x/y Diagramm = dot plot dargestellt 1) Granulozyten 2) Monozyten 3) Lymphozyten 2-Parameter dot plot
Fluoreszenzmessung mit dem Durchflusszytometer Analyse von Lymphozyten- Subpopulationen Problem: Lymphozyten können nicht anhand ihres Streulichts unterschieden werden Daher müssen sie mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern markiert werden: z. B. Fluorescein anti-cd3 für T-Zellen Phycoerythrin anti-cd19 für B-Zellen
Ergebnisanalyse Für jede Zelle wurden fünf Parameter gespeichert: FSC SSC 1.) Fluoreszenz (grün) 2.) Fluoreszenz (orange) 3.) Fluoreszenz (rot) B-Lymphozyten T-Lymphozyten Auswahl der Zellen entsprechend ihrer spezifischen FSC/SSC Characteristika = gating
Leukämie Healthy control
HIV-Infektion Healthy control Patient shows reduced numbers of T-helper-cell in peripher blood
Intrazelluläre Zytokinfärbung Kultivierung von T-Helfer-Zellen unter verschiedenen Bedingungen Zugabe von Brefeldin A: hemmt die Zytokinsekretion Fixierung in Formaldehyd Permeabilisierung mit Saponin Färbung mit anti-ifn-γ-fluorescein und anti-il-4-phycoerythrin
Fluorescence assisted cell sorting FACS =Fluorescence Assisted Cell Sorting Jede Zelle befindet sich in einem einzelnen Tropfen. Jeder Tropfen erhält eine elektrische Ladung und wird mit Hilfe von Ablenkplatten sortiert. Ablenkplatten Sortierte Zellen Matthias Stiehm, 3.2.2006
Magnetische Zellsortierung (MACS) Zellisolierung mit spezifischen Antikörpern, die an magnetische Partikel gebunden sind Prinzip: Anlegen eines Magnetfelds Zellen werden mit Antikörpern beladen, die magnetische Partikel tragen und auf eine Säule geladen Unmarkierte Zellen werden herausgewaschen Nach Entfernen des Magnetfelds werden die markierten Zellen eluiert
Agglutination von Antikörpern in Lösung Detektion von Antikörpern auf einer Matrix (ELISA, Western Blot, Immunfluoreszenz) Durchflusszytometrie und Zellsortierung (FACS) Detektion von zellulären Immunantworten
Nachweis einer Immunreaktion in vivo (Tuberkulosetest) Tine-Test Heute ersetzt durch den Mendel-Mantoux-Test, bei dem die Menge des injizieten Tuberculins genau festgelegt ist.
Antigenspezifische Th1-Zellen Typ-IV Reaktion (Hypersensitivitätsreaktion des verzögerten Typs) IFN-γ, Chemokine, TNF-α IFN-g IFNg-Receptor APC Lokale Entzündung
Elispot-Assay: erkennt Zytokin-produzierende Zellen in vitro
CFSE Assay zur Proliferationsmessung O CH 3 CH 3 O O O O OH O O O primäre Amine, Esterasen, ph>7 O OH O O N O O Protein NH O + N-Hydroxysuccinimid + 2 Moleküle Essigsäure Lymphozyten des menschlichen Blutes markiert mit CFSE Carboxyfluorescein Diacetatsuccinimidylester. Die Zellen wurden mit Phytohaemagglutinin stimuliert und 5 Tage inkubiert.