Der Wurzelraum von Pflanzen (Rhizosphäre)

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1 Abteilung Rhizosphärenbiologie Institut für Bodenökologie Department of Rhizosphere Biology Institute of Soil Ecology Neuherberg Die Institute (Leiter / Head: Prof. Dr. Anton Hartmann) Der Wurzelraum von Pflanzen (Rhizosphäre) stellt ein physiologisch sehr aktives Bodenkompartiment dar. Die Rhizosphäre hat entscheidende Bedeutung für die Nährstoffversorgung und die Gesundheit der Pflanzen sowie für die (Fremd)-Stofftransformation und den Stoffabbau. Bei der Ausprägung physiologischer Leistungen in der Rhizosphäre sind Signalstoffe innerhalb der mikrobiellen Gemeinschaft sowie zwischen Mikroorganismen und Pflanzen wichtig. Die Interaktion von Rhizosphärenbakterien und der Wurzel soll deshalb auch auf genomischer und proteomischer Ebene untersucht werden. Ziel ist es, die vertieften Erkenntnisse zur Etablierung von gewünschten biochemischen Leistungen der Rhizosphäre, wie verbesserten Pflanzenertrag, Pathogenabwehr und Fremdstoffabbau, zu nutzen. Die experimentellen Arbeiten werden sowohl in Labormodellen als auch in Gewächshausund Freilandstudien durchgeführt. Im Bereich Mikrobielle Ökologie der Rhizosphäre werden molekulargenetische und bildverarbeitungsgestützte mikroskopische Verfahren eingesetzt, um die Struktur und Funktion der Rhizosphärenmikroflora aufzuklären. Insbesondere wird durch die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung oder spezifische Fluoreszenzmarkierungen von Bakterien (mit gfp- oder rfp- Gen) und Laser-Scanning-Mikroskopie eine In-situ-Lokalisierung bestimmter Bakterien und ihrer Leistungen in der Rhizosphäre ermöglicht. T he root zone of plants (rhizosphere) is a very active soil compartment. The rhizosphere is of key importance for the supply of nutrition to plants and for plant health, as well as in the transformation and degradation of natural and anthropogenic organic compounds. The establishment of physiological functions in the rhizosphere is controlled by signalling compounds within the rhizosphere microbial community and between microbes and plants. The interaction of rhizosphere bacteria and roots is studied at the genomic and expression level. The aim of the research is to use in depth knowledge of the molecular interplay in the rhizosphere to establish desired biochemical traits such as improved plant productivity, disease resistance, and pollutant degradation. The experimental work is performed in laboratory model, greenhouse, and field studies. Under Microbial Ecology of the Rhizosphere, molecular genetic methods and microscopic approaches supported by image analysis are used to investigate the structure and function of rhizosphere microbial populations. Fluorescence in situ hybridisation and specific fluorescence labelling of bacteria (with gfp or rfp genes), together with confocal laser scanning microscopy, enable in situ localisation of selected bacteria and their activities in the rhizosphere. GSF 133

2 Im Bereich Dynamik der Rhizosphäre werden Funktionsveränderungen im Wurzelraum erfasst, die durch den Eintrag von Fremdstoffen (z.b. Agrochemikalien) hervorgerufen werden. Dabei werden pflanzliche Entgiftungsreaktionen mit proteinchemischen Methoden untersucht sowie zytologische Studien zum Transport von Fremdstoffmetaboliten im Wurzelsystem verschiedener Modellpflanzen durchgeführt. Beteiligung von IBÖ-ARB an POF-Programmen: Die Forschungsvorhaben der Abteilung sind in das Programm Biogeosystems: Dynamics, Adaptation and Adjustment des Helmholtz-Forschungsbereichs Erde und Umwelt integriert. Dabei werden im Programmthema 4.3 Stress and Adaptation: Plants in varying environments vor allem der Arbeitsschwerpunkt 2 Dynamic interactions between plants and their environment bearbeitet. Ziel ist es, Mechanismen der Wechselwirkungen von Mikroorganismen der Rhizosphäre und der Wurzel zu verstehen, die zur Verbesserung der Ernährung und der Gesundheit von Pflanzen und zur Optimierung des Schadstoffabbaus in der Rhizosphäre führen. Die Forschungsarbeiten werden in Zusammenarbeit mit dem Institut für Phytosphäre (ICG-III), Forschungszentrum Jülich (FZJ), und den GSF-Instituten für Biochemische Pflanzenpathologie (BIOP), Ökologische Chemie (IÖC), Biomathematik/Biometrie (IBB) und Grundwasserökologie (IGÖ) durchgeführt. Das Überzeichnungsprojekt der GSF Funktionelle Genomik und Metabolomik der molekularen Interaktionen in der Rhizosphäre wird von der Abteilung koordiniert. Zusammen mit dem BIOP, dem Institut für Phytosphäre des FZJ, dem MPI für chemische Ökologie, Jena, und dem Lehrstuhl für Tierökologie der TU Darmstadt ist die Abteilung am Virtuellen Institut für Biotische Interaktionen (VIBI) der HGF beteiligt. Die Abteilung ist im Institut für Bodenökologie integriert. Im Jahr 2005 waren 6 Wissenschaftler/innen, 5 Doktorand/innen, 4 Diplomand/innen, 1,5 technische Mitarbeiter/innen und 2 Mitarbeiterinnen im freiwilligen ökologischen Jahr (FöJ) in der Abteilung beschäftigt. Weiter waren 7 Gastwis- Under Dynamics of the Rhizosphere, activity changes in the rhizosphere are measured that are induced by the input of xenobiotics (e.g., agrochemicals). Detoxification reactions of the roots are investigated using protein chemical methods, and cytological studies are performed on the transport of metabolites of xenobiotics in the root zone of various model plants. Department of Rhizosphere Biology Participation in POF Programmes: Research in the Department is integrated into the Helmholtz research programme on Biogeosystems: Dynamics, Adaptation and Adjustment in the research field Earth and Environment. The focus is on the programme central research area 4.3 Stress and Adaptation: Plants in Varying Environments, research focus 2 Dynamic Interactions between Plants and their Environment. The aim is to elucidate the mechanisms of the interactions of the microorganisms in the rhizosphere and roots that lead to improvements in plant nutrition and health and optimisation of the degradation of pollutants in the rhizosphere. The research is performed in collaboration with the Phytosphere Institute (ICG-III) of the Research Centre Julich (FZJ), and the GSF Institutes of Biochemical Plant Pathology (BIOP), Ecological Chemistry (IÖC), Biomathematics/Biometry (IBB) and Groundwater Ecology (IGÖ). The Department coordinates the GSF additional funding project Functional genomics and metabolomics of molecular interactions in the rhizosphere. The Department participates in the HGF Virtual Institute on Biotic Interactions (VIBI) together with BIOP, the FZJ Phytosphere Institute, the Max-Planck- Institute of Chemical Ecology, Jena, and the Chair of Zoo-Ecology of the TU Darmstadt. The Department is integrated into the Institute of Soil Ecology. In 2005 there were 6 scientists, 5 postgraduate and 4 undergraduate students, 1,5 technicians, 2 young people doing their voluntary ecological service year, and 7 visiting scientists from different European, African and Indian countries in the Department. 134 GSF

3 senschaftler(innen) aus verschiedenen Ländern Europas, Afrikas und Indien in der Abteilung tätig. Bakterien in der Mykorrhizosphäre C. Kellermann, J. Bertaux, R. Yara, M. Schmid und A. Hartmann Die Symbiosen von Pilzen (Basidiomyceten) mit den Wurzeln von Waldbäumen gemäßigter Breiten sind von entscheidender Bedeutung für die Versorgung der Bäume mit Nährelementen und Wasser aus dem Boden. Im Rahmen des Sonderforschungsbereichs 607 Wachstum oder Parasitenabwehr und Zusammenarbeit mit dem INRA- Centre de Nancy (Joanne Bertaux) und der Universität von Piracicaba, Brasilien (Ricardo Yara) wurden die Vergesellschaftung von Mykorrhizapilzen mit Bodenbakterien im Detail untersucht. Die Diversität der Mykorrhiza-assoziierten Bakteriengemeinschaft wurde einerseits durch die Klonierung der bakteriellen ribosomalen RNS-Gene erfasst und andererseits durch die in situ Analytik der Mykorrhiza-assoziierten Bakteriengemeinschaft mit Hilfe von fluoreszenz-markierten Oligonukleotidsonden in der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) und mit konfokaler Laser Scanning Mikroskopie untersucht. Diversität bei Ectomykorrhiza-assoziierten Bakterien Drei verschiedene Ectomykorrhizen (Lactarius subdulcis, Russula ochroleuca, Xerocomus chrysenteron) wurden mit Hilfe der Expertise von Prof. Reinhard Agerer (LMU München) im Kranzberger Forst bei Freising aus dem O f - und A h - Horizont des Waldbodens unter Fichte und Buche isoliert. Aus DNS-Extrakten dieses von anhaftendem Boden befreiten Mykorrhizamaterials wurden die 16S rrns-gene mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert und nach Klonieren in E. coli sequenziert. Die vollständigen, ca Nukleotide langen Sequenzen wurden mit Hilfe der ARB-Software phylogenetisch analysiert. In allen drei Ectomykorrhizen ergab sich überraschenderweise folgendes Ergebnis: neben Sequenzen von verschiedenen Klassen von größtenteils gut bekannten Gram-negativen Bakterien wurden in zum Teil mehr als der Hälfte der Fälle Sequenzen von Acidobacterium gefunden. In dieser Entwicklungslinie von Bakterien sind bisher nur wenige Bakterienreinkulturen bekannt; bisher erschließt sich die hohe Diversität der Acidobacterien fast nur aus sehr zahlreichen 16S rdns- Sequenzen, die aus Böden und Sedimenten unterschiedlichster Ökosysteme weltweit erhalten wurden. Erstmalig sind nun auch Acidobacterien-Sequenzen aus der Ectomykorrhizosphäre erhalten worden. Zurzeit werden in Zusammenarbeit mit Dr. Wolfgang Ludwig vom Lehrstuhl für Mikrobiologie der TU München neue phylogenetische Sonden für Acidobakterien getestet, um diese bedeutende Bakteriengruppe auch direkt in situ darstellen zu können. In situ-analytik der Bakteriengemeinschaft Die ribosomale RNS als molekularer phylogenetischer Marker erlaubt auch die direkte Identifizierung von Bakterien im natürlichen Habitat. Dabei werden einerseits fluoreszenz-markierte Oligonucleotidsonden (EUB338-Mix) eingesetzt, welche die gesamten Bakterien umfassen. Bei der FISH-Methode werden allerdings nur diejenigen Bakterien erfasst, welche einen hohen Gehalt an Ribosomen (und damit ribosomale RNS) enthalten und damit hochaktiv sind, sowie auch durch die Fixierung für die Sondenmarkierung zugänglich gemacht werden können. Andererseits wurden mit dem DNS-bindenden Fluoreszenzfarbstoff DAPI alle vorhandenen Bakterien gefärbt. Ferner wurden zur detaillierten Analyse Oligonukleotidsonden, welche spezifisch für bestimmte Gram-negative oder Grampositive Bakterien sind, eingesetzt. Es zeigte sich, dass % der auf mykorrhizierten Wurzelspitzen und Mykorrhiza-Hyphen vorkommenden Bakterien aktiv sind und einen hohen Ribosomengehalt besitzen (Abb. 1). Die Zahl der mit Ektomykorrhizen assoziierten Bakterien kann sehr unterschiedlich sein; die Spannbreite ist von kaum kolonisiert bis zu Bakterien pro mm 2 Mykorrhizaoberfläche je nach Mykorrhiza-Art und Bodenbedingungen. Die Institute GSF 135

4 10 µm A B C 5 µm 5 µm D Abb. 1: Laser Scanning Mikroskopische Aufnahme von Bakterienzellen auf Hyphen des Mykorrhizapilzes Fagirhiza pallida: Fluoreszenz in situ Hybridisierung mit den Sonden EUB338- Mix/Cy3, Bet42a/FLUOS und Gam42a/CY5 stellen beta-proteobakterien gelb und Eubakterien rot dar; gamma-proteobakterien (magenta) sind fast keine vorhanden. 5 µm 5 µm Abb. 2: Endofungische Bakterien in Laccaria bicolor 2238N: FISH-CLSM-Analyse mit einer Kombination verschiedener 16S rrna gerichteter Gensonden: A: ohne Sonde B: mit EUB338mix/FLUOS C: mit BIF216/Cy3 (spezifisch für Paenibacillus sp.) D: Überlagerung von A+B+C Endofungische Bakterien in Ektomykorrhizen Mit den Möglichkeiten der exakten Lokalisierung von Bakterien in der Hyphosphäre stellte sich auch die Frage, ob Bakterien auch innerhalb von Pilzen vorkommen. Dies war erstmals in Sporen von arbuskulären Mykorryhizapilzen nachgewiesen worden. In Zusammenarbeit mit dem INRA-Centre de Nancy wurde im Detail untersucht, ob der Ektomykorrhizapilz Laccaria bicolor S238N Bakterien innerhalb seiner Hyphen enthält. Dieser Pilz wird zur Steigerung der Wüchsigkeit von Föhren in Aufforstungen verwendet und muss dazu in Fermentern vermehrt werden. Hierbei ist den französischen Kollegen um Jean Garbaye und Pascale Frey- Klett aufgefallen, dass in den Fermentern aus zunächst unerklärlichen Gründen manchmal auch Bakterien wachsen, obwohl nur mit der Pilzreinkultur angeimpft worden war. Eine detaillierte Identifizierung des Bakteriums ergab schließlich, dass es sich hierbei immer um einen Paenibacillus sp. handelt. Mit Hilfe von Oligonukleotidsonden, die spezifisch auf der Basis der 16S rdna entwickelt wurden, konnte dieses Bakterium tatsächlich in den Hyphen von Laccaria bicolor 238N nachgewiesen werden (Abb. 2). Offensichtlich kann dieses Bakterium lange Zeit unerkannt im Pilz leben und nur zu bestimmten Gelegenheiten (z.b. unter den Bedingungen der Fermenterkultur) als freilebendes Bakterium auftauchen. Bei weiteren Untersuchungen von Mykorrhizen von Laccaria bicolor S238N sowohl in Gewächshäusern an inokulierten Wurzeln von Eichen- und Föhrenkeimlingen als auch in einem Eichenwald im Forst von Champenoux ergaben, dass mit großer Regelmäßigkeit endofungische Bakterien in L. bicolor vorkommen. In diesem Fall sind die Bakterien jedoch größtenteils nicht als Grampositive Paenibacillus sp. sondern als Gramnegative Alpha-Proteobakterien mit Hilfe von entsprechenden Oligonukleotidsonden identifiziert worden (Abb. 3). Offensichtlich können bestimmte Bakterien des Waldbodens diesen Pilz nicht nur äußerlich sondern auch im Inneren der Hyphen besiedeln. Es gibt keinen Hinweis, dass es sich bei den besiedelten Hyphen um abgestorbenes Material handelt oder dass der Pilz durch diese Bakterienbesiedlung geschädigt ist. Es muß sich also um eine nicht-pathogene 136 GSF

5 5 µm 5 µm Die Institute Abb. 3: Endofungische Bakterien in Laccaria bicolor aus Waldboden, identifiziert mit den Oligonukleotidsonden ALF1b/Cy5 und EUB338mix/Cy3 in der FISH/CLSM-Analytik. Abb. 4: Endofungische Bakterien in Pleurotus ostreatus: Der kombinierte Einsatz der Sonden EUB338mix/Cy3 und SUBU123/Cy5 zeigen magenta gefärbte Burkholderia sp. in der FISH/CLSM-Analyse innerhalb der Hyphen. Bakterien-Pilz Wechselwirkung handeln, deren eigentliche Funktion noch nicht verstanden ist. Endofungische Bakterien in saprotrophen Pilzen Um die Allgemeinheit von endofungischen Bakterien weiter zu belegen, wurden auch saprophytische Pilze in die Untersuchungen einbezogen. Sowohl in verschiedenen Isolaten des essbaren Pilzes Pleurotus ostreatus als auch in einer Reihe anderer Pilze konnten mit Hilfe eines speziellen Mediums Bakterien in Kultur gebracht werden, die man in den als bakterienfrei betrachteten Pilzkulturen nicht vermutet hätte. Weiterhin konnten durch verschiedene mikroskopische Techniken bakterien-ähnliche Strukturen innerhalb von Pilzhyphen nachgewiesen werden. Der letzte Beweis, dass es sich dabei um Bakterien handelt, gelang durch die Kombination von fluoreszenz-markierten Oligonukleotidsonden, die für bestimmte Bakterien spezifisch sind und der FISH- Analytik gekoppelt mit konfokaler Laser Scanning Mikroskopie. In P. ostreatus wurden sowohl über Klonbanken der bakteriellen 16S rdna-gene als auch mit Hilfe einer Burkholderia-spezifischen Sonde SUBU1237 Bakterien der Gattung Burkholderia in den Hyphen von P. ostreatus nachweisen. Die mikroskopischen Befunde sprechen dafür, dass es sich hier um Bakterien handelt, die in den Pilzhyphen eine mycoplasma-ähnliche Form annehmen können, denen offensichtlich die Zellwand fehlt. Außer den Burkholderien konnten auch Hinweise für weitere interessante Pilz-assoziierte Bakterien gefunden werden, die für den Abbau von komplexen organischen Substanzen oder multiple Antibiotikaresistenz bekannt sind. GSF 137

6 Zusammenarbeit Die Abteilung pflegt eine intensive Zusammenarbeit mit beiden Münchner Universitäten; A. Hartmann lehrt an der Fakultät für Biologie der Ludwig-Maximilians- Universität München das Fach Bodenmikrobiologie, während P. Schröder an der TU München im Department Ökologie Spezielle Pflanzenphysiologie lehrt. Wissenschaftler der Abteilung kooperieren mit zahlreichen ausländischen Forschungseinrichtungen: Center for Microbial Ecology, Michigan State University, East Lansing, USA Centre INRA de Nancy, Champenoux, Frankreich Brooks College, Oxford, England Instituto Superior Técnico, Centre for Biological an Chemical Engineering, Lissabon, Portugal Istituto di Biochimica ed Ecofisiologia Vegetali, Rom, Italien Universität für Bodenkultur, Institut für Bodenforschung, Wien, Österreich EPFL in Lausanne, Schweiz Tschechische Akademie der Wissenschaften, Prag, Tschechien. Banaras Hindu Univ., Varanasi, Indien Ben-Gurion Univ. of the Negev, Sede Boker Campus, Israel Sonderfinanzierte Vorhaben wurden mit Unterstützung des Bayer. Staatsm. für Umweltfragen, der DFG, BMBF und Daimler-Benz-Stiftung durchgeführt. A. Hartmann leitet den Lysimeterlenkungsausschuss der GSF und ist Mitglied in der Münchner Arbeitsgemeinschaft Luftschadstoffe. Er ist Koordinator der Arbeitsgruppe Biology of the Rhizosphere in der EU-COST Action 631. Es bestehen wissenschaftliche Kooperationen innerhalb der GSF und mit dem Lehrstuhl für Mikrobiologie der TU München. P. Schröder ist Koordinator des Versuchsguts Scheyern der GSF. Er ist Koordinator der Arbeitsgruppe Organic Xenobiotics in der EU-Cost Action 837 und Obmann des Arbeitskreises Bioindikation der GDCh. Es bestehen wissenschaftliche Kooperationen innerhalb der GSF und mit dem Lehrstuhl für Botanik der TU München. Ausgewählte Veröffentlichungen Bertaux, J., Schmid, M., Hutzler, P., Hartmann, A., Garbaye, J., Frey-Klett, P.: Occurrence and distribution of endobacteria in the plant-associated mycelium of the ectomycorrhizal fungus Laccaria bicolor S238N. Environ. Microbiol. 7, (2005) Courty, P.-E., Pritsch, K., Schloter, M., Hartmann, A., Garbaye, J.: Activity profiling of ectomycorrhiza communities in two forest soils using multiple enzymatic tests. New Phytol. 167, (2005) Rothballer, M., Schmid, M., Fekete, A., Hartmann, A.: Comparative in situ analysis of ipdc-gfpmut3 promotor fusions of Azospirillum brasilense strains Sp7 and Sp245. Environ. Microbiol. 7, (2005) Schröder, P., Maier, H., Debus, R.*: Detoxification of herbicides in Phragmites australis. Z. Naturforsch. C, 60, (2005) 138 GSF