Biokatalytische Synthese chiraler γ-diole und γ-hydroxyketone

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1 Forschungsverbund der Deutschen Bundesstiftung Umwelt "InnovationsCentrum Biokatalyse" Gesamtkoordination: Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed Antranikian, TU Hamburg-Harburg Abschlussbericht für das Verbundvorhaben: Biokatalytische Synthese chiraler γ-diole und γ-hydroxyketone Az Verbundpartner: Institut für Biochemie der TU Dresden Institut für Molekulare Enzymtechnologie der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Julich Chiral Solutions GmbH a Codexis Company Wacker AG

2 Projektbearbeiter Prof. Dr. Martin Bertau Dipl.-Lebm.Chem. Michael Katzberg Dipl.-Biol. Kerstin Wechler Prof. Dr. Werner Hummel Dipl.-Chem. Marion Müller Dr. Pascal Dünkelmann Dr. Jürgen Stohrer Dr. Christian Peschko TU Bergakademie Freiberg ehemals TU Dresden TU Dresden TU Dresden Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Julich Chiral Solutions GmbH- a Codexis Company ehemals Jülich Fine Chemicals GmbH Wacker AG ehemals Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Wacker AG ehemals Consortium für elektrochemische Industrie GmbH

3 Inhalt Inhalt PRJEKTBEARBEITER... I INHALT... II ZUSAMMENFASSUNG ANLASS UND ZIELSETZUNG DES PRJEKTES MATERIAL UND METHDEN ERGEBNISSE UNTERSUCHUNG VN (2S,5S)-HEXANDIL ALS STRESSAUSLÖSENDES AGENS IDENTIFIKATIN VN STRESSANTWRTEN UND ISLIERUNG DER ALS STRESSANTWRT INDUZIERTEN ENZYME MIT DEHYDRGENASE-AKTIVITÄT Bildung von Nebenprodukten aus Xenobiotika Mikrobielle Nebenprodukte Beeinflussung der Zellphysiologie Toxizität von 2,5-Hexandion Einfluss auf die Glycolyse und den Pentosephosphatweg Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (RS) Als Stressantwort induzierte Enzyme mit Dehydrogenaseaktivität Gesamtreduktaseaktivität Stressabhängigkeit der Reduktaseaktivität Identifizierung und Charakterisierung der Reduktasen durch Untersuchung von Mutanten INHIBITIN DER STRESSENZYME PTIMIERUNG DES ENERGIEHAUSHALTS DER ZELLE PTIMIERUNG DES GANZZELL-VERFAHRENS REINIGUNG DER NATIVEN 2,5-HEXANDIN-REDUKTASE AUS NICHT GESTRESSTEN ZELLEN Anzahl der 2,5-Hexandion-Reduktasen (HDR) Identifizierung der HDR Eigenschaften von Yol151wp (Gre2p) (HDR) Heterologe Expression von GRE2 in E.coli und Reinigung von rec-gre2p Substratspektrum von Gre2p II -

4 Inhalt 3.7 HERSTELLUNG VN (5S)-HYDRXY-2-HEXANN ENZYMATISCHE SYNTHESE MIT ISLIERTEN ENZYMEN AUS S. CEREVISIAE ENZYMATISCHE SYNTHESE MIT DEHYDRGENASEN ALTERNATIVER MIKRRGANISMEN Biokatalytische Synthese der Enantiomere des 2,5-Hexandiols Biokatalytische Synthese anderer Diole und Hydroxyketone SLL-/IST-VERGLEICH TU DRESDEN, INSTITUT FÜR BICHEMIE HHU DÜSSELDRF, INSTITUT FÜR MLEKULARE ENZYMTECHNLGIE JULICH CHIRAL SLUTINS GMBH, A CDEXIS CMPANY EHEMALS JÜLICH FINE CHEMICAL GMBH WACKER AG EHEMALS CNSRTIUM FÜR ELEKTRCHEMISCHE INDUSTRIE GMBH KMMERZIALISIERUNG ÖKEFFIZIENZANALYSE DISKUSSIN KPERATIN VERÖFFENTLICHUNGEN LITERATURVERZEICHNIS ANHANG ZUSAMMENSTELLUNG DER ERGEBNISSE DER ÖKEFFIZIENZANALYSE III -

5 Zusammenfassung Zusammenfassung Als nachhaltige und ressourcenschonende Alternative zur klassisch angewandten katalytischen Hydrierung durch Übergangsmetallkomplexkatalysatoren wurde die Ganzzell-Biotransformation von 2,5-Hexandion (1) zu (2S,5S)-Hexandiol (3) optimiert, um einen ökologisch und ökonomisch effizienteren Zugang zum Produkt verfügbar zu machen und damit eine Kommerzialisierung im industriellen Maßstab zu ermöglichen. Im Ergebnis dieser Arbeiten konnte eine Hexandiolreduktase aus Saccharomyces cerevisiae gereinigt, identifiziert und heterolog exprimiert werden. Gleichzeitig zeigten sich ausgesprochen vielfältige und komplexe Wechselwirkungen zwischen Edukt 1 und dem Ganzzell-Biokatalysator, die einen kommerziellen Einsatz der Ganzzell-Variante nicht zulassen. Dagegen konnte gezeigt werden, dass sich Hefereduktasen eignen, selektiv das Hydroxyketon (5S)-Hydroxy-2-hexanon (2) zu bilden. Damit steht erstmals ein selektiver Zugang zu stereoisomerenreinen Verbindungen dieser Substanzklasse offen. Ebenfalls sehr erfolgreich ließ sich die Synthese des Diols 3 realisieren, indem keine Hefeenzyme, sondern bakterielle Enzyme eingesetzt wurden. Sie erlauben erstmals den vollständigen Umsatz von 1 in hoher Chemo- und Stereoselektivität. Der Erfolg dieser Variante lag im kontinuierlichen Entfernen des xidationsproduktes Aceton aus der Reaktionsmischung, welches aus dem zur Kofaktorregenerierung verwendeten Isopropanol stammt. Bakterielle Enzyme wurden erforderlich, da allein diese in der Lage sind, sowohl das Dion zu reduzieren als auch Isopropanol zu oxidieren. Damit konnte das Projekt sehr erfolgreich durchgeführt werden. Es existiert eine selektive Synthesemethode für das Hydroxyketon 2 sowie mehrere Synthesewege für das Diol 3. Dabei erwies sich die Nutzung bakterieller Dehydrogenasen als effizientester Weg zu enantiomerenreinem 3 und wurde daher auch konsequenterweise in der Ökoeffizienzanalyse mit dem bisher etablierten, übergangsmetallkatalysierten Verfahren verglichen. Im Ergebnis zeigt sich die ökologische und ökonomische Überlegenheit des neuen biokatalytischen Verfahrens, was damit auch als ökoeffizienter zu bewerten ist. Durch die Erweiterung der Untersuchungen auf andere Diketone konnte das Ziel einer neuen Syntheseplattform für chirale Diole und Hydroxyketone erreicht werden

6 Anlass und Zielsetzung 1. Anlass und Zielsetzung des Projektes (2S,5S)-Hexandiol (3) ist eine Vorstufe chiraler Phosphin-Katalysatoren (Burk et al., 1993; Brunel & Faure, 2004) und chiraler pharmazeutischer Intermediate (Dietz et al., 2004). Unter den derzeit bestehenden Synthesetechnologien erweist sich die katalytische Hydrierung, unter Verwendung von Übergangsmetallkomplexen, als bisher leistungsfähigstes Verfahren und entspricht demnach dem Stand der Technik. Das Verfahren wurde von Fan, 1997 dokumentiert, erweist sich jedoch in punkto Diastereoselektivität (de 68%) als unbefriedigend. Eine leistungsfähige Alternative bietet die Ganzzell-Reduktion von 1 mit Saccharomyces cerevisiae. Allerdings gelingt es nach derzeitigem Stand nicht, 3 ohne signifikante Verunreinigungen mit dem Monoreduktionsprodukt 2 zu synthetisieren (Abbildung 1). CH 3 H 3 C 1 NAD(P)H/H + NAD(P) + (S) CH 3 H 3 C Abbildung 1. Biokatalytische Synthese 1 3. NAD(P)H/H + H NAD(P) + (S) CH 3 H 3 C (S) 2 H 3 Die Ganzzellbiotransformation von 1 mit S. cerevisiae liefert 3 in bis zu 57 % Ausbeute (95 % ee) (Lieser, 1983). Hauptkomplikation ist die Reaktion des Intermediats 2 zum cytotoxischen (S)-Dimethyldihydrofuran. In der Folge reichert sich 2 im Medium an und mündet in einem Rückgang der Reduktion 2 3. Im Extremfall kommt die Biotransformation vollständig zum Erliegen, weswegen angenommen wurde, dass xenobiotischer Zellstress die Biotransformation in erheblicher Weise beeinflusst. Dafür spricht die deutlich erhöhte Glutathionkonzentration in der Hefezelle. Die ptimierungsstrategie sah vor, die mit der Reduktion assoziierten, Zellstressphänomene aufzuklären um daraus reproduzierbar hohe Ausbeuten und Stereoisomerenreinheiten zu erhalten. Im Rahmen des Projektes sollte die Synthese von (2S,5S)- Hexandiol (3) und des Zwischenprodukts 2 im kommerziellen Maßstab untersucht werden. Als Biokatalysatoren waren S. cerevisiae als Ganzzell-System sowie isolierte Enzyme aus der Hefe zu testen. Die, im Rahmen eigener Vorarbeiten, gewonnenen Ergebnisse belegten den Einfluss von Zellstress auf die Ganzzell-Biotransformation von 1. Gegenstand des vorliegenden Projektes sind reproduzierbar hohe Ausbeuten ( 95 %) und eine hohe Stereoisomerenreinheit ( 99 % ee, 99 % de) für (2S,5S)-Hexandiol (3). H - 2 -

7 Anlass und Zielsetzung Im Vorfeld der ptimierung werden fünf verschiedene Teilstrategien verfolgt: 1. Identifikation und Isolierung der nativen Reduktaseaktivität 2. Untersuchung von (2S,5S)-Hexandiol (3) als stressauslösendes Agens 3. Identifikation von Stressantworten und Isolierung der, als Stressantwort induzierten, Enzyme mit Dehydrogenaseaktivität 4. Inhibierung der Stressenzyme 5. ptimierung des Energiehaushaltes der Zelle Insbesondere Teilschritt (1) dient der Entwicklung eines enzymkatalysierten Synthese-Prozesses. Abhängig vom erforderlichen Koenzym dieser Enzyme sollen sie mit einer entsprechenden Reaktion zur Regenerierung des Koenzyms gekoppelt werden. Als wichtigstes Ziel hinter den ptimierungsbemühungen steht die Umweltentlastung. Insbesondere das, in punkto Toxizität, kritisch zu bewertende Methanol, welches Verwendung im klassisch chemischen Verfahren findet, sollte vermieden werden. Die dabei anfallende Abfallmenge von 57 kg/kg Produkt zeigt, dass dieser Prozess weder ressourcenschonend noch umweltfreundlich ist. Zwar ist durch Verwendung des Ganzzellbiokatalysators S. cerevisiae schon eine Umweltentlastung durch Vermeidung von Methanol gegeben, jedoch lassen sich durch Selektivitätsteigerungen Ausbeuteverluste und Abfallmengen noch weiter reduzieren. Durch den vollständigen Umsatz 1 3 wird eine optimale Ressourcenausnutzung gewährleistet. Die aufwendige, kostentreibende Separation des Diols 3 vom Intermediat 2 soll, infolge des reproduzierbar hohen Umsatzes (>95 %), entfallen. Damit würde das gesamte Verfahren nicht nur erheblich verkürzt, sondern auch die Anzahl der, mit hohem Arbeits- und Energieaufwand verbundenen und damit kostenintensiven, Produktionsschritte verringert. Aus ökonomischer Sicht werden durch das Projekt erheblich geringere Gestehungskosten erwartet die etwa um den Faktor 5 niedriger liegen sollen. Für die kommerzielle Produktion von 2 kann kein Kostenvergleich vorgelegt werden, da bisher keine kommerzielle Produktion erfolgt. Vielmehr schafft erst die erfolgreiche Bearbeitung dieses Projektes die Basis für die großmaßstäbliche Synthese dieser Verbindung. Aus ökologischer Sicht schont der Ansatz des vorliegenden Projektes Ressourcen, indem das Edukt 1 bei hoher Atomökonomie (>95 %) in das Produkt 3 überführt wird. Angestrebt wird eine Ausbeute von ca. 95 % gegenüber bisher %. Dadurch wird das Edukt nahezu optimal verwertet, was zur Realisierung der angestrebten, - 3 -

8 Anlass und Zielsetzung drastischen Reduktion der Abfallmengen beiträgt. Ferner entfällt durch die hohe A- tomökonomie die Trennproblematik, was die Abfallmengen und die, für den Downstream-Prozess benötigte, Energie reduziert. Damit sind die ökonomischen Vorteile Ausdruck der hohen ökologischen Effizienz des Verfahrens

9 Material und Methoden 2. Material und Methoden Umsatzanalytik: Gaschromatographische Trennung an Carbowax 20M (50 m x 0,32 mm x 0,5 µm) N 2 (0,8 bar). Temperaturprogramm: 70 C (10 min) - 12 K/min - >160 C (32 min). R t : 2,5-Hexandion 22,32 min; 5-Hydroxy-2-hexanon 25,81 min; 2,5-Hexandiol 35,32 min. Enantiomerenanalytik: Gaschromatographische Trennung an Cyclodex beta I/P (50 m x 0,25 mm) nach Derivatisierung mit Trifluoressiganhydrid und Methoxylamin. Trennparameter: Tägergas: H 2 (0.5 bar). Temperaturprogramm: 50 C(45 min) - 20 K/min-> 100 C (15 min) 40 K/min-> 170 C (5 min). R t : (2S,5S)-Hexandiol 49.0 min; (2R,5R)-Hexandiol 49.3 min; meso-hexandiol 50,3 min; (5S)-Hydroxy-2- hexanon: 52.2 und 52.7 min 1 ; (5R)-Hydroxy-2-hexanon: 51.5 und 52.4 min 1. rganismen: S. cerevisiae L13 (FALA, Strasbourg); Y03288; Y02376; Y04204; Y01932; Y07391; Y06908; Y03821; Y00569; Y01819; Y00000; TMB4091, -92, -96, -93, -94 und 97; Zellaufschluss: Nach Hummel & Kula (1989) bzw. Harder et al. (1999). Proteinbestimmung: Nach Bradford (1976) bzw. Granum & Whitaker (1980). Bestimmung der Reduktaseaktivität: Photometrische Messung des NAD(P)H- Verbrauchs bei 340 nm. Reaktionsparameter: 970 µl 10 mm Substrat-Lösung, 20 µl Kofaktor-Lösung 10 mm, 10 µl Enzym-Lösung (10 mg/ml), Temperatur 30 C, alle Lösungen in 0.1 M KP-Puffer (ph 7,0). Enzymatische Umsetzung von Diketonen: Reaktionsparameter: ADH 1 U/ml, GDH (CDX) 1 U/ml, Substrat-Konzentration 200 mm, Glucose-Konzentration 500 mm, [CaC 3 ] = 600 mm, alle Lösungen in KP-Puffer (0.1 M, ph 7,0), Temperatur 30 C, Reaktionszeit 24 h. Bestimmung von Pyrrolen: Nach Hidalgo et al. (1998). Bestimmung von Glucose: Mittels D-Glucose-spezifischem Sensor. Bestimmung reaktiver Sauerstoffspezies (RS):Nach Madeo et al. (1999) und Wysocki & Kron (2004) mittels Durchflußcytometrie. Vitalitätsbestimmung: mittels Hämacytometer nach Methylenblaufärbung. Biotransformationen: Nach Jörg et al. (2005). 2D-Gelelektrophorese: 250 µl der Probe wurden auf einen IPG-Streifen aufgebracht. Innerhalb von 16 h erfolgte die aktive Rehydrierung des Streifens, während 1 Die Derivatisierung der Hydroxyketone mit Methoxylamin führt zu 2 diastereomeren Methoximen pro Enantiomer. Folglich resultieren 2 Retentionszeiten pro Enantiomer

10 Material und Methoden die isoelektrische Fokussierung bei steigender Spannung in den folgenden 8 h stattfand. Daraufhin wurde der IPG-Streifen einmal für 15 min in Puffer mit DTT und darauf folgend in Puffer mit Iodacetamid äquilibriert. Der IPG-Streifen wurde auf ein 12%iges Polyacrylamidgel aufgebracht und durch eine Agaroselösung mit diesem verbunden. Nach Elektrophorese bei 12,5 W für ca. 3 h wurde eine Silber- (Mortz et al., 2001) bzw. Coomassiefärbung (Neuhoff et al., 1988) durchgeführt. Herstellung des Rohextrakts und Ermittlung der Bezugsgrößen: Mit 25 g Bäckerhefe wurde ein 33%-iger Zellaufschluss mit 100 mm TEA ph 6,5; 1 mm DTT u. 1 mm MgCl 2 durchgeführt. Mit der doppelten Menge Glasperlen (Ø 0,5-0,75 mm) zum Suspensionsvolumen wurden die Zellen aufgeschlossen und die Zelltrümmer anschließend abzentrifugiert. Der Überstand wurde auf Aktivität gegenüber 2,5-Hexandion untersucht. Der Standardaktivitätstest enthielt 15 mm 2,5-Hexandion, 100 mm TEA ph 7,0 und 0,25 mm NAD(P)H. Reinigung der Hefe-Reduktase: Für die hydrophobe Interaktionschromatographie wurde der Rohextrakt mit 1 M (NH 4 ) 2 S 4 versetzt und anschließend auf eine, mit 100 mm TEA ph 6,5; 1 mm DTT; 1 mm MgCl 2 und 1 M (NH 4 ) 2 S 4, äquilibrierte Butyl- 4FF-Sepharose-Säule (Volumen 30 ml, Fluss 1 ml/ml) aufgetragen. Die Säule wurde mit 85 ml des gleichen Puffers gewaschen und anschließend die Konzentration des (NH 4 ) 2 S 4 über einen linearen Gradienten bis auf 0 % verringert. Die aktiven Proteinfraktionen wurden auf eine, mit 100 mm TEA ph 6,5; 1 mm DTT und 1 mm MgCl 2, äquilibrierte Q-Sepharose-Säule (Volumen 9 ml, Fluss 1 ml/min) aufgetragen. Die Säule wurde mit 25 ml des gleichen Puffers gespült und anschließend die Proteine durch einen linear steigenden Gradienten bis 1,5 M NaCl eluiert. Die erhaltene Proteinlösung wurde auf eine, mit 5 mm KP i ph 6,5, 1 mm DTT und 1 mm MgCl 2, äquilibrierte Hydroxyapatit-Säule (Volumen 8 ml, Fluss 1 ml/min) aufgetragen, die anschließend mit 25 ml des gleichen Puffers gewaschen wurde. Die Elution der Proteine erfolgte mit einem linear steigenden P 3-4 -Gradienten bis 50 mm. Bestimmung des Molekulargewichts: Superdex 200 p.g.-säule (Volumen 122,6 ml, Fluss 1 ml/min). Die Durchführung erfolgte isokratisch mit 150 mm TEA ph 6,5; 1 mm DTT, 1 mm MgCl 2 und 150 mm NaCl. Anhand der Kalibriergerade und des Elutionsvolumens (72 ml) wurde durch Berechnung des K av -Werts das Molekulargewicht bestimmt

11 Ergebnisse 3. Ergebnisse 3.1. Untersuchung von (2S,5S)-Hexandiol als stressauslösendes Agens Produktinduzierter Stress kann von 3 in Analogie zu Ethanol durch eine Beeinträchtigung der Zellmembran erwartet werden. Vergleichende Untersuchungen zeigten jedoch, dass die Cytotoxizität von 3 geringer ist als die von 1 und 2. Somit sind 1 und 2 als stressauslösende Faktoren relevanter und müssen eingehender untersucht werden als 3. Eine eventuell auftretende Reoxidation 3 1 liefert N-reaktive Carbonylgruppen. Untersuchungen am Rohextrakt von S. cerevisiae zeigten bei ph 7,0 keine xidationsaktivität in Gegenwart von NAD +. Mit NADP + wurde eine Aktivität von 4 mu/mg (Protein) gemessen. Im Vergleich zur Reduktaseaktivität (60 mu/mg (Protein)) ist somit die Reoxidation von 3 bzw. 2 im Cytosol des Ganzzellbiokatalysators (ph ~ 6.5 (Valli, 2005)), vernachlässigbar Identifikation von Stressantworten und Isolierung der als Stressantwort induzierten Enzyme mit Dehydrogenaseaktivität Ausgangspunkt dieser Arbeiten war, dass der mikrobielle Biokatalysator xenobiotischem Stress ausgesetzt ist. Dabei gelten Lebensbedingungen, die für eine Zelle nicht optimal sind als Stressbedingungen. Dies ist immer dann gegeben, wenn der Mikroorganismus einer nicht-natürlichen Substanz ausgesetzt ist, für deren Verstoffwechselung es konsequenterweise keinen natürlichen Abbauweg gibt. Dabei kann der xenobiotische Stress nicht nur durch das Edukt bzw. Produkt ausgelöst werden, sondern auch durch Eduktverunreinigungen oder Nebenprodukte. Es ist daher auch unerlässlich zunächst neugebildete bzw. eingetragene Nebenprodukte nicht nur als Produktverunreinigung, sondern auch als mögliche Stressoren zu identifizieren um anschließend ihren Einfluss auf die Bioreduktion bewerten zu können. Die so identifizierten, möglichen Stressoren können Einfluss auf das Proteom (z.b. Bildung neuer Dehydrogenasen) und auf das Metabolom (z.b. GSH-Titer) haben

12 Ergebnisse Bildung von Nebenprodukten aus Xenobiotika Bedingt durch die Reaktivität von 1 und 2 kommt es zu einer Reihe von Reaktionen wozu insbesondere intra- und intermolekulare Zyklisierungen zu Furanen bzw. Pyrrolen zählen sowie Reaktionen mit Glutathion (GSH) (Abbildung 2). Intramolekulare Zyklisierung von 1 führt zu 2,5-Dimethylfuran (5) und 3-Methyl-cyclopentenon (4), wobei für beide ein ausschließlicher Eintrag über das Edukt festgestellt wurde. Eine Neubildung während der Bioreduktion spielt daher keine Rolle. Insbesondere 4, ein potentielles Fungizid welches mit N- und S-Nucleophilen reagieren kann, ist in kommerzieller Ware in Konzentrationen bis zu 5% enthalten und ließ sich durch Destillation bis auf <1% reduzieren. Lediglich im Edukt in der Qualität der Firma Wacker liegt es in Anteilen <1 % vor. bwohl die Gegenwart von 0,25% 4 nur einen geringen Vitalitätsverlust(1%) bei S. cerevisiae zur Folge hatte, konnte eine vermehrte Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies beobachtet werden. In Verbindung mit der Beobachtung, das S. cerevisiae 4 nur langsam reduziert (4 15) und damit entgiften kann, muss geschlussfolgert werden, dass die Konzentration von 4 im Edukt gering gehalten werden muss um Einflüsse auf den Biokatalysator zu minimieren. Die Intramolekulare Zyklisierung des Hydroxyketons 2 führt zum Auftreten des entsprechenden Halbacetals (11), welches durch Wasserabspaltung in das reaktive 2,3- Dihydro-2,5-dimethyl-furan (12) übergeht. Dieser Reaktionsweg hätte eine stetige Entfernung des Hydroxyketons 2 zur Folge was sich wiederum negativ auf die Ausbeute an Produkt 3 auswirken würde. Unter den gewählten Biotransformationsbedingungen tritt diese Reaktion jedoch kaum in Erscheinung, so dass eine verlustfreie, vollständige Reduktion möglich ist. Die Reaktion wird jedoch nach der Entfernung des Lösemittels Wasser z.b. während der Produktisolierung oder der Lagerung von reinem 2 bedeutsam und führt in diesem Fall zu Ausbeuteverlusten an 2. Intermolekulare Zyklisierungen wie die Bildung proteingebundener Pyrrole (10) aus der Reaktion von 1 mit Aminogruppen konnte in vivo nachgewiesen werden

13 Ergebnisse H 2 H 3 C CH 3 5 H 2 CH 3 4 NADH/H + NAD + CH 3 14 CH 3 H 3 C H 15 CH 3 H CH 3 H 3 C 6 H SG GS H 16 CH 3 H 3 C 7 H SG GSH CH 3 H 3 C 1 (S) CH 3 H 3 C 2 H H (S) CH 3 H 3 C (S) 3 H R NH 2 GSH H 2 R NH 2 H 2 R NH CH 3 H 3 C H C CH 3 N 3 10 R R NH 2 R H 2 NH CH 3 H 3 C vernetzte Proteine HN R 9 CH 3 H 3 C H H C CH GS H H 3 C (S) CH 3 8 H R NH H 2 (S) CH 3 H 3 C 13 H H 2 xidationsprodukte Abbildung 2. Reaktionswege von 2,5-Hexandion (1). Im Laufe einer Batch-Biotransformation steigt die Menge proteingebundener Pyrrole an, solange 1 nicht größtenteils umgesetzt ist. Sind von dieser Modifizierung auch essentielle Aminogruppen in aktiven Zentren oder Kofaktorbindungsstellen betroffen, kommt es zur Inhibierung oder sogar zum kompletten Funktionsverlust betroffener Enzyme. Als Beispiel sei hier die Inhibition der glycolytischen Enzyme Phosphofructokinase und Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase durch 1 genannt (Sabri, 1984; Howland et al. 1980). Ein signifikanter Verlust an Edukt durch Reaktion mit Glutathion konnte unter den gewählten Biotransformationsbedingungen in vitro nicht beobachtet werden. In vivo ist jedoch eine Bildung von Semithioacetalen (6, 7, 8) durch das Vorhandensein von Mikroumgebungen (z.b. im aktiven Zentrum eines Enzyms) nicht auszuschließen, was zur Beeinträchtigung von Enzymen mit, für deren Aktivität, essentiellen Thiolgruppen führen kann Mikrobielle Nebenprodukte Neben Ethanol bildet die Hefezelle weitere Metaboliten, die vom Produkt (3) abgetrennt werden müssen (Tabelle 1). Die Menge an organischen Säuren ist proportional zur initialen 2,5-Hexandion-konzentration, was darauf hindeutet, dass die Konzentration oxidierter Kofaktoren in der Zelle mit steigender Eduktkonzentration zunimmt. Das kann als Indiz dafür gewertet werden, dass die Zelle nicht in der Lage ist, ausreichend Reduktionsäquivalente bereitzustellen, um eine schnelle Reduktion zum Diol 3 zu ermöglichen

14 Ergebnisse Tabelle 1. Mikrobielle Nebenprodukte Nebenprodukt Typischer Gehalt in Batch Biotransformation Ethanol 17 g/l Essigsäure Spuren 2-Methyl-pentanol 0,2 g/l 3-Methyl-butanol 0,4 g/l Phenylethanol 0,1 g/l 2-Methyl-valeriansäure 0,1-0,3 g/l 3-Methyl-buttersäure 0,1-0,4 g/l Somit ist die geringe Geschwindigkeit der Umsetzung 1 3 nicht nur eine Frage der Eigenschaften bzw. der Inhibierung des Enzyms. Vielmehr deutet sie darauf hin, dass der Einsatz eines Ganzzell-Biokatalysators für diese Reaktion sehr kritisch zu hinterfragen ist Beeinflussung der Zellphysiologie Toxizität von 2,5-Hexandion 1 erwies sich als wenig toxisch für ruhende Zellen in der stationären Phase. Bioreduktionen mit 50 g/l Edukt hatten in diesem Fall nur geringe Vitalitätseinbußen zur Folge (Vitalität 90 %). Weitere Tests ergaben, dass die Reduktionsprodukte von 1 (2 und 3) eine geringere Toxizität als 1 aufweisen. Es kommt also im Laufe der Bioreduktion zur Entgiftung des xenobiotischen Substrats Einfluss auf die Glycolyse und den Pentosephosphatweg In vitro erwies sich 1 als Inhibitor des wichtigen glycolytischen Enzyms Glyceraldehyd-3-phosphate-dehydrogenase. Dies konnte, in Abhängigkeit der initialen Konzentration an 1, auch in vivo beobachtet werden. Allerdings zeigte die hohe glycolytische Aktivität der Zellen, dass hiermit keine signifikante Beeinträchtigung des Zuckerstoffwechsels einherging. Wichtiger ist die Beobachtung, dass auch das Schlüsselenzym des Pentosephosphatwegs, die Glucose-6-phosphat-dehydrogenase(G6PDH), durch 1 gehemmt wurde. Da G6PDH ein Schlüsselenzym zur Regenerierung von NADPH in vivo darstellt, limitieren hohe Konzentrationen an 1 bzw. eine chronische Exposition, die NADPH Regenerierung. Dies hätte eine Reduktion der Umsatzgeschwindigkeit von 1 und eine Störung der zellulären Redoxhomöostase zur Folge

15 Ergebnisse Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (RS) Unter aeroben Bedingungen entstehen stetig reaktive Sauerstoffspezies (RS), welche die Zelle unter normalen Bedingungen sofort entgiften kann (Halliwell & Whiteman, 2004; Bartosz, 2003). In Gegenwart von Xenobiotika kann das Redoxgleichgewicht jedoch gestört sein. Im Fall von 1 kann dies durch Inhibierung von RS entgiftenden bzw. GSH regenerierenden Enzymen oder durch Konjugatbildung mit GSH der Fall sein. Die Folge ist oxidativer Stress. Letzterer kann den Biokatalysator schädigen bzw. Stressantworten der Zelle provozieren, die zur Induktion von Reduktasen führen kann. Der in-vivo-nachweis von RS erfolgte nach Etablierung einer durchflusscytometrischen Methode mit Dihydrorhodamin 123 und Dihydrofluoresceindiacetat als Fluoreszenzsonden. Versuche, mit 2,5-Hexandion-Konzentrationen von 0-3 % (v/v) 1, ergaben keine Hinweise auf eine vermehrte Bildung von RS. Erst ab 5 % (v/v) 1 konnten nach 24 h in geringem Maße RS nachgewiesen werden. RS werden somit nur in Batchverfahren mit Eduktkonzentrationen > 50 g/l 1 wirksam. In Fed-Batch- Systemen besteht diese Gefahr somit nicht, solange der Gehalt an 3- Methylcyclopentenon (4) niedrig gehalten wird. So zeigten Zellen welche 0.25% 4 ausgesetzt waren, eine leicht erhöhte Bildung von RS Als Stressantwort induzierte Enzyme mit Dehydrogenaseaktivität Recherchen in der Literatur zur genomweiten Expressionsanalyse unter verschiedenen Stressbedingungen ergaben, dass die Expression eines Großteils der Gene, welche für Dehydrogenasen codieren, durch Stress verändert wird (Gasch et al., 2000; Garay-Arroyo und Covarrubias, 1999). Daher wurde zum einen die Abhängigkeit der Gesamtreduktaseaktivität von Stressparametern bestimmt und zum anderen Arbeiten zur Identifikation von 2,5-Hexandion-Reduktasen (HDR) vorgenommen. Dabei fiel der Focus zunächst auf die Gruppe der Aldo-Keto-Reduktasen, welche durch ihr hohes Expressionslevel in wildtyp S. cerevisiae und der Bandbreite an akzeptierten Substraten, als relevant für Biotransformationen eingestuft werden können

16 Ergebnisse Gesamtreduktaseaktivität Die Bestimmung der Gesamtreduktaseaktivität im Rohextrakt von S. cerevisiae ergab eine Präferenz der 2,5-Hexandion reduzierenden Dehydrogenase (HDR) für den Kofaktor NADPH. Die Michaelis-Menten Konstante und die scheinbare maximale Geschwindigkeit wurde für die Gesamtheit aller 1 reduzierenden Enzyme, für die Substrate 1 und 2 (Reduktion) bzw. 2 und 3 (xidation) bestimmt. Die kinetischen Konstanten zeigen, das die Akkumulation von 2 vor allem kinetisch begründet werden kann. So wird 2 aufgrund der geringeren Maximalgeschwindigkeit der HDR für die Reaktion (2 3) langsamer reduziert, was zu einer höheren Chemoselektivität, in bezug auf die Produktion des Hydroxyketons 2 führt. Der Ganzzellbiokatalysator S. cerevisiae bzw. die, daraus isolierte HDR sind somit geeignete Katalysatoren für einen biokatalytischen Zugang zu enantiomerenreinem Stressabhängigkeit der Reduktaseaktivität Die Gesamtreduktaseaktivität der Zelle wird durch verschiedene Stresssituationen beeinflusst. Untersuchungen ergaben eine Induktion der HDR in wachsenden Zellen, welche osmotischem Stress bzw. Hitzestress ausgesetzt waren. Weiterhin zeigten Zellen, welche sich in der stationären Phase befanden, eine höhere HDR-Aktivität als wachsende Zellen in der exponentiellen Phase. Die höchste Aktivität wurde nach Induktion durch osmotischen Stress festgestellt und lag im Rohextrakt bei 130 mu/mg(protein). Weiterhin wurde auch festgestellt, dass durch Zusatz von Stressoren, die Aktivität von Zellen in der stationären Phase, welche ohnehin eine erhöhte HDR-Grundaktivität aufweisen (70 mu/mg(protein)), nicht in dem Maße gesteigert werden kann wie dies für Zellen in der exponentiellen Phase beobachtet werden konnte. Eine Steigerung auf mu/mg(protein) ist jedoch möglich. Dies zeigt, dass eine maximale HDR-Aktivität in S. cerevisiae(wildtyp) existiert, die allein durch Stressexposition nicht unbegrenzt steigerbar ist Identifizierung und Charakterisierung der Reduktasen durch Untersuchung von Mutanten Ein Vergleich der Literaturergebnisse aus genomweiten Expressionsanalysen mit den, von uns erhaltenen, Daten zur Induktion der HDR während unterschiedlicher Stresssituationen legt nahe, dass die HDR ähnlich einer Gruppe von Genen, zusammengefasst unter dem berbegriff environmental stress response genes (ESR)

17 Ergebnisse reguliert wird. Die Expression dieser Gene wird ebenfalls durch unterschiedliche Stressoren beeinflusst (Gasch, 2000). Von den in dieser Gruppe befindlichen Dehydrogenasen (15) sind 9 als für Biotransformationen relevant eingestuft worden (Stewart, 2001). Die Dominanz der Aldo-Keto-Reduktasen in dieser Gruppe (5 von 6 Genen werden zum ESR gezählt) gab den Ausschlag diese als mögliche HDR zu untersuchen. Weiterhin wurde das, auch durch den ESR regulierte, Protein Gre2p mit untersucht. Die Bestimmung der Aktivität gegenüber 1 wurden mit Deletions- und, wenn möglich, auch mit Überexpressionsmutanten 2 durchgeführt. Die Expression der Gene auf dem Plasmid erfolgt konstitutiv in S. cerevisiae, so dass nahe den tatsächlichen Gegebenheiten des nativen Mikroorganismus gearbeitet werden konnte (Tabelle 2). Tabelle 2. Relative Reduktaseaktivität in Bezug auf den unveränderten Wildtyp in % für verschiedene Dione in Deletions- bzw. Überexpressionsmutanten Gen YBR149w YR120w YL151w YHR104w (ARA1) (GCY1) (GRE2) (GRE3) Substrat ,5-Hexandion < ,3-Butandion ,4-Pentandion NB Gen Substrat YDR368w (YPR1) ++ YJR096w YDL124w YMR226c 2,5-Hexandion ,3-Butandion ,4-Pentandion nicht durchführbar, da Aktivität gegenüber dem Substrat zu gering war; 2- nicht durchführbar, da Mutante nicht verfügbar; 3- S. cerevisiae BY 4741 Mutante, in welcher das Gen deletiert ist 4- S. cerevisiae CEN.PK 113-7D Mutante, in welcher das Gen konstitutiv überexprimiert wird; 5- relative Reduktaseaktivität bezogen auf die Aktivität des unveränderten Wildtyps Die so erhaltenen Daten zeigen, dass Aldo-Keto-Reduktasen 2,5-Hexandion zwar akzeptieren (Vergleich Überexpressionsmutante GCY1) jedoch in wildtyp 2 Freundlicherweise vom Institut für Angewandte Mikrobiologie der Universität Lund, Schweden zur Verfügung gestellt

18 Ergebnisse S. cerevisiae Gre2p für dessen Umsetzung verantwortlich ist (vergl. Aktivitätsverlust in Deletionsmutante). Im Fall von 2,5-Hexandion kann hier also der seltene Fall beobachtet werden, dass in wildtyp S. cerevisiae nur ein Enzym vorrangig für dessen Umsetzung verantwortlich ist. Die Beobachtung das 1 in Batch-Experimenten mit S. cerevisiae GRE2 trotzdem sehr langsam umgesetzt wird, stützt die Beobachtung, dass auch andere Dehydrogenasen zu Reduktion von 1, wenn auch mit geringer Aktivität, befähigt sind(vergleich GCY1 Tabelle 2). Die Umsetzung von 2,4-Pentandion konnte nur in Überexpressionsmutanten untersucht werden, da die Aktivität in wildtyp-s. cerevisiae zu gering war um vergleichende Untersuchungen anzustellen. Folglich muss, trotz der Eignung von Ypr1p für dessen Umsetzung, mit einer vergleichsweise geringen Umsatzgeschwindigkeit gerechnet werden. 2,3-Butandion wird insbesondere von Ara1p akzeptiert und wurde daher auch als Diacetylreduktase bezeichnet. Weiterhin akzeptiert auch Ymr226cp 2,3- Butandion sehr gut. bige Ergebnisse bestätigen die von Katz (2003) erhaltenen Substratspezifitäten für 2,3-Butandion. Die Aktivität der Deletionsmutanten gegenüber 2,3-Butandion zeigt, dass Ara1p auch in wildtyp S. cerevisiae eine wichtige Rolle bei der Umsetzung von 2,3-Butandion spielt, jedoch nicht alleinig für dessen Reduktion verantwortlich ist Inhibition der Stressenzyme Es konnte gezeigt werden, dass Enzyme welche am Umsatz von 1 beteiligt sind stressinduzierbar sind. Dazu gehört auch das, für den Großteil der Aktivität verantwortliche, Enzym Gre2p dessen Expression durch Stress stark beeinflusst wird (Garay-Arroyo, 1999; Rep, 2001). Eine Inhibierung dieser Enzyme wäre nur dann sinnvoll, wenn unerwünschte Reduktaseaktivität das Reaktionsergebnis erheblich beeinflussen würde. Die Beobachtung, dass sich die Aktivität durch Stress sogar steigern ließ ohne das Selektivitätseinbußen hingenommen werden mussten, macht eine Inhibierung von Stressenzymen nicht notwendig. Eine weitere Voraussetzung wäre, dass die Ganzzellvariante deutlich bessere Umsätze erwarten ließe als die Umsetzung mit isolierten Enzymen, was aber nach gegenwärtigem Kenntnisstand nicht der Fall ist. Exemplarisch konnte gezeigt werden, dass N-Ethylmaleinimid (NEM) sowie Quercetin die gesamte 1 reduzierende Enzymaktivität hemmen

19 Ergebnisse 3.4. ptimierung des Energiehaushalts der Zelle S. cerevisiae kann, neben Saccharose und Glucose, auch andere Kohlenstoffquellen wie Ethanol, Glycerin, Galactose, Raffinose oder Acetat nutzen. Damit einher geht eine Induktion von Enzymen welche dem Katabolismus der entsprechenden Kohlenstoffquellen dienen. Im Fall von Galactose ist dies, die, der Aldo-Keto-Reduktase- Familie zugehörige, Gcy1p (Hur & Wilson, 2000), welche 1 als Substrat akzeptiert (Tabelle 2). Eine erhöhte Expression durch Änderung der Kohlenstoffquelle könnte sich somit positiv auf die Reaktionsgeschwindigkeit ausüben. Andere Kohlenstoffquellen wurden auf eine höhere Ausbeute an Redoxäquivalenten hin untersucht. In Batch-Biotransformationen mit 1 % (v/v) 1 wurden alternative Kohlenstoffquellen langsamer verbraucht, womit die Umsetzung auch langsamer ablief. Die Bereitstellung von Redoxäquivalenten erfährt auf diese Weise keinen Vorteil, weswegen ptimierungsarbeiten mit Saccharose durchgeführt wurden. Auch konnte in Gegenwart von Galaktose keine höhere HDR-Aktivität festgestellt werden ptimierung des Ganzzell-Verfahrens Die Durchführung eines optimierten Ganzzellverfahrens wird durch die Erkenntnisse zur Nebenproduktbildung und der Interaktion zwischen Ganzzellbiokatalysator und xenobiotischen Substraten in Verbindung mit den Ergebnissen zur Abhängigkeit der HDR-Aktivität in S. cerevisiae, möglich. Die durch Stress induzierbare HDR weist jedoch ein Maximum auf, was in wildtyp-s. cerevisiae ohne Anwendung gentechnischer Methoden nicht weiter gesteigert werden kann. Durch die, im Allgemeinen, geringe Aktivität des Pentosephosphatwegs in S. cerevisiae und der gleichzeitigen Inhibierung der Glucose-6-phosphat-dehydrogenase muss mit einer nicht-optimalen Regenerierung von NADPH in vivo gerechnet werden, was sich wiederum nachteilig auf die Umsatzgeschwindigkeit auswirkt. Damit ist der Umsatzgeschwindigkeit und der Raum-Zeit-Ausbeute (STY) in diesem Verfahren ein Limit (STY: ca. 9 g(3)l -1 d -1 ) gesetzt was durch Anwendung isolierter Enzyme durchbrochen werden kann. Die Ergebnisse der detaillierten Untersuchungen der Ganzzellbiotransformation von 1 können genutzt werden um sowohl Nebenproduktbildung als auch Beeinflussung des Biokatalysators durch Nebenprodukte zu minimieren. Der Einfluss auf die Zellphysiologie durch das Edukt 1 lässt sich jedoch nicht vollständig unterdrücken. Dabei spielt insbesondere die Beeinträchtigung wichtiger Katabolismuswege eine Rolle

20 Ergebnisse (Pentosephosphatweg, Glycolyse). Die Minimierung eduktvermittelter Effekte auf die Zelle kann also nur durch niedrige Konzentrationen an 1 erreicht werden (Batch- Prozess mit niedriger Konzentration an 1 bzw. Fed-Batch-Prozess). Im verbesserten Ganzzellverfahren können Ausbeuten an Diol 3 um 88% und hohe Selektivitäten erzielt werden (ee, de >99%). Die geringe Raum-Zeit-Ausbeute bleibt jedoch ein Problem was durch die Nutzung isolierter HDR behoben werden kann Reinigung der nativen 2,5-Hexandion-Reduktase aus nicht gestressten Zellen Der Rohextrakt frisch aufgeschlossener Hefezellen wurde auf die Reduktion von 2,5- Hexandion mit NADPH als Reduktionsäquivalent hin gereinigt. Im ersten Schritt wurde der Rohextrakt mit 1 M (NH 4 ) 2 S 4 versetzt und damit für die säulenchromatographische Reinigung vorbereitet. Es folgte die Reinigung der HDR über Q- Sepharose-, Hydroxyapatit- und Superdex G75-Material. Abbildung 3: SDS-Gel der Reinigung der 2,5-Hexandion-Reduktase (HDR). Nach der Ammoniumsulfatfällung des Hefe-Rohextraktes waren vier chromatographische Schritte zur Reinigung der HDR aus dem Rohextrakt nötig. Dabei wurde nach dem letzten Reinigungsschritt eine spezifische Aktivität der Reduktion von 2,5-Hexandion von über 68 U/mg erzielt. Das entspricht einem Reinigungsfaktor von

21 Ergebnisse Letztlich konnte die HDR mit einem Reinigungsfaktor von 680 aus dem Rohextrakt gereinigt werden. Die spezifische Aktivität für die Reduktion von 2,5-Hexandion konnte nach dem letzten Reinigungsschritt mit über 68 U/mg verzeichnet werden. Abbildung 3 zeigt das SDS-Gel der Reinigung Anzahl der 2,5-Hexandion-Reduktasen (HDR) Um die Anzahl der, in S. cerevisiae für die Umsetzung von 2,5-Hexandion (1), verantwortlichen Reduktasen zu bestimmen wurde partiell gereinigtes Enzym verwendet. Abbildung 4 zeigt die Umsetzung von 1. Das Reduktionsäquivalent NADPH wurde durch Glucose-Dehydrogenase regeneriert. Bereits nach 3 h wurde das Substrat vollständig in das γ-diol 3 umgesetzt. Demnach kann von einem Enzym im Hefe-Rohextrakt ausgegangen werden, dass die Reduktion von 1 katalysiert, was auch durch die Untersuchungen der Deletionsmutanten gestützt wird (Tabelle 2) ,5-Hexandion 5-Hydroxy-2-hexenon 2,5-Hexandiol 80 Umsetzung (%) Zeit(min) Abbildung 4: Umsetzung von 1 mit partiell gereinigtem Enzym. Die frühe vollständige Umsetzung des Substrats deutet auf eine HDR hin Identifizierung der HDR Bei Betrachtung der Aktivitäten und Proteinkonzentrationen der aufgetragenen, gereinigten Proteinlösungen, zeigte sich, dass nur das Protein bei 39 kda die verantwortliche HDR (Pfeil in Abbildung 3) darstellten kann. Um das Enzym zu identifizieren, wurde die prägnante Proteinbande aus dem Gel ausgeschnitten, tryptisch verdaut und die Massen, der entstandenen Peptide, im MALDI-TF-MS bei einer Massenspannweite von Da bestimmt. Von einer sicheren Identifizierung wurde ausgegangen, wenn mindestens vier der experimentell bestimmten Peptidmassen

22 Ergebnisse mit den vorhergesagten Massen übereinstimmten und mehr als 25 % des Proteins mit den identifizierten Peptiden abgedeckt werden konnten, wobei die Unterschiede zwischen gemessener und theoretischer Masse maximal 100 ppm betragen durfte. Zudem wurde ein MWSE-Score (Maß für die Qualität eines Ergebnisses) größer als 10 3 verlangt. Dem Mass-Print-Vergleich des verdauten Proteins konnte auf diese Weise eindeutig die NADPH-abhängige xidoreduktase (Gen-Name: YL151w), die unter dem Namen Methylglyoxal-Reduktase bekannt ist (Chen, et al., 2003), zugeordnet werden. Das Ergebnis ist in Tabelle 3 wiedergegeben. Tabelle 3: Zusammenfassung der MALDI-TF Ergebnisse. Gre2p ist die gesuchte HDR. MWSE-Score übereinstimmende Massen Sequenz-Übereinstimmung Protein Gen-Lokus Gen-Name Name des Protein/ (%) (Mw(Da)/pI) Funktion 2,77e (7) /5.8 YL151w GRE2 Gre2p/ NADPHabhängige Methylglyoxal- Reduktase Eigenschaften von Yol151wp (Gre2p) (HDR) Gre2p zeigt ein Temperaturoptimum bei 45 C und ein ph-ptimum bei ph = 6,5. Das Enzym zeigt in Analogie zu den Ganzzellexperimenten keine Reoxidationstendenz, der K M -Wert für 1 beträgt 3,05 mm. Mittels Größenausschlusschromatographie wurde das Molekulargewicht zu ca. 50 kda bestimmt. Das Enzym besteht aus zwei identischen ca. 25 kda großen Monomeren. Biochemisch gehört es in die Unterklasse der short-chain Dehydrogenasen/Reduktasen (SDR). Es ist nicht metallionenabhängig, was für die Klasse der SDR typisch ist Heterologe Expression von GRE2 in E.coli und Reinigung von rec-gre2p Aus genomischer DNA wurde mit spezifischen Primern GRE2 amplifiziert, und in den Expressionsvektor pet-21a(+) kloniert. Die Expression erfolgte bei verschiedenen Temperaturen sowie unterschiedlich langer Inkubationsdauer als auch unterschiedlichen IPTG-Endkonzentrationen. Der nach der Ernte erhaltene Rohextrakt wurde auf die Reduktionseigenschaft von 2,5-Hexandion hin überprüft. Dabei konnte die höchste spezifische Aktivität (0,67 U/mg) bei 37 C, 0,2 mm IPTG-Endkonzentration und 5 h Inkubationsdauer erzielt werden. Nach zwei chromatographischen Reinigungsschritten (Butyl-Sepharose und Hydroxyapatit) konnte diese auf 56 U/mg erhöht werden. Durch Beseitigung weniger Fremdproteine ist diese Aktivität noch weiter steigerbar

23 Ergebnisse Substratspektrum von Gre2p Für die Aufnahme eines Substratspektrums wurde rec-gre2p verwendet. Dabei wurde die spezifische Aktivität 50 U/mg für Reduktion von 2,5-Hexandion als Referenz auf 100% gesetzt. Die eingesetzte Endkonzentration des jeweiligen Substrats war 15 mm. Als Kofaktor wurde NADPH verwendet. Die Aktivitäten für die entsprechenden Substrate sind in Tab. 4 veranschaulicht. Tabelle 4: Substratspektrum der rekombinanten Gre2p. Die spezifische Aktivität mit 2,5- Hexandion diente als Referenz und wurde auf 100% gesetzt. Daraus geht hervor, dass mit n-ctanal und 4-Chlor-3-oxobutansäureethylester höhere Aktivitäten als für das Referenzsubstrat erzielt werden können. Auffallend ist auch, dass Gre2p eine höhere Neigung zur Reduktion halogenierter, anstatt unhalogenierter β-keto-ester besitzt und letztere gegenüber den Diketonen sogar bevorzugt werden. Im Falle von Diketonen wird 2,5-Hexandion am Besten verwertet, während

24 Ergebnisse mit anderen Diketonen (2,3-Butandion und 2,4-Pentandion) nur eine geringe Aktivität erzielt wird was jedoch durch Erhöhung der Gre2p-Konzentration in in vitro Reduktionsansätzen ausgeglichen werden kann, so dass die Reduktion einer ganzen Reihe von Diketonen mit diesem Biokatalysator möglich wird. 3.7 Herstellung von (5S)-Hydroxy-2-hexanon Es wurde festgestellt, dass Biokatalysatoren, welche sich zur Produktion von 3 eigenen, auch für die Synthese von 2 eingesetzt werden können. Da es sich bei der Reduktion von 1 um eine Folgereaktion handelt kommt es zu einer vorübergehenden Akkumulierung von 2. Das Ausmaß der Akkumulierung von 2 und damit die Chemoselektivität des untersuchten Biokatalysators für 2 wird durch seine kinetischen Parameter bestimmt. Vergleiche zwischen dem bakteriellen Biokatalysator ADH-T und S. cerevisiae bezüglich kinetischer Konstanten und dem Verhalten in Batch- Experimenten, zeigten, dass S. cerevisiae bzw. die daraus isolierte 2,5-Hexandionreduktase, eine höhere Chemoselektivität als ADH-T für die Reduktion 1 2 zeigt. Dies resultiert in einer bis zu 30% höheren Akkumulation von 2 bei der Verwendung von S. cerevisiae bzw. der daraus isolierten HDR. Kontrolliert man den Prozess kinetisch, ist es möglich zum Zeitpunkt der Maximalkonzentration von 2, ein Produktgemisch zu erhalten wobei bis zu 90% des eingesetzten 2,5-Hexandions als (5S)- Hydroxy-2-hexanon vorliegen. Isoliert man das so gewonnene (5S)-2, zeigt sich seine hohe Stereoisomerenreinheit (ee >99%). Wie unter Punkt erwähnt, ist 2 in der Lage intramolekular zu zyklisieren. Insbesondere während der Lagerung und Isolierung von 2 tritt dieser Reaktionsweg in Erscheinung. Da diese Zyklisierung in wässriger Lösung nicht beobachtet wird ist es vorteilhaft 2 als wässrige Lösung zu lagern oder aber sich anschließende Reaktionen als Eintopfsynthese durchzuführen. Ist eine Isolierung des reinen Produktes notwendig, so müssen Ausbeuteverluste hingenommen werden. Durch den Einsatz des Biokatalysators S. cerevisiae bzw. der, daraus isolierten, HDR ist es somit erstmals möglich einen Zugang zu enantiomerenreinem (5S)-Hydroxy-2-hexanon mit hoher Selektivität zu erhalten

25 Ergebnisse 3.8. Enzymatische Synthese mit isolierten Enzymen aus S. cerevisiae Bei dem derzeit etablierten biotechnologischen Verfahren zur Synthese von 3 wird 1 in einer Ganzzelltransformation mit Bäckerhefe umgesetzt. Nachdem die Untersuchungen mit dem Ganzzell-Biokatalysator und gentechnisch veränderten Stämmen gezeigt hatten, dass verschiedene Dehydrogenasen in der Lage sind, 1 und andere Diketone zu reduzieren, lag es nahe, aus Bäckerhefe isolierte, Dehydrogenasen hinsichtlich ihres Potentials, Diole und Hydroxyketone aus den entsprechenden Diketonen zu generieren, zu untersuchen. Die folgenden Hefe-Enzyme sind für kommerzielle Zwecke in ausreichenden Mengen verfügbar und wurden in diesem Zusammenhang geprüft: Ygl039wp, Ydl124wp, Y- ol151wp(gre2p) und Ydr368wp(Ypr1p). Zu diesem Zweck wurden zunächst photometrische Screenings durchgeführt, bei welchen die Aktivitäten der vier Dehydrogenasen in Bezug auf die jeweiligen Diketone bestimmt wurden (Tabelle 5). Tabelle 5. Spezifische in-vitro-aktivitäten in U/mg Protein Spezifische Aktivität YGL039w YDL124w YL151w YDR368w 2,3-Butandion 0,5 1,03 0,2 20,3 2,4-Pentandion 0,54 0,29 0,35 1,46 2,5-Hexandion 0,55 0,40 2,1 0,51 3,5-Heptandion 0,40 0,22 0,21 2,86 3,6-ctandion 0,39 0,23 0,24 0,20 2,7-Dimethyloctan-3,6-dion 0,52 0,28 0,87 0,17 Wie den Ergebnissen in Tabelle 5 zu entnehmen ist, zeigen alle Enzyme Aktivität in Gegenwart der eingesetzten Substrate. Mit wenigen Ausnahmen bewegen sich alle Enzymaktivitäten in der gleichen, relativ niedrigen Größenordnung (<1 U/mg). Hohe spezifische Aktivitäten (>10 U/mg) sind lediglich für Ydr368wp mit 2,3-Butandion zu verzeichnen, moderate Aktivitäten (>1 U/mg) zeigen Ydl124wp mit 2,3-Butandion, sowie Ydr368wp mit 2,4-Pentandion und 3,5-Heptandion. Die Aktivität von Yol151wp gegenüber 2,5-Hexandion bestätigt die Ergebnisse zur Reinigung der HDR aus S. cerevisiae. Da bei den photometrischen Screenings lediglich Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten ermittelt werden, wurden einige der oben aufgeführten Diketone in Kleinansätzen mit den Reduktasen aus Bäckerhefe umgesetzt. Die dabei gewonnenen Ergebnisse gibt Tabelle 6 wieder. Wie schon beim photometrischen Screening verhalten sich die

26 Ergebnisse untersuchten Reduktasen auch bei den Kleinansätzen ähnlich. Alle vier akzeptieren 2,4-Pentandion und 3,5-Heptandion als Substrate. Die Umsetzung von 3,6-ctandion gelang in Kleinansätzen nicht. Für alle betrachteten Dehydrogenasen stellt 3,5-Heptandion das bessere Substrat dar. In diesen Ansätzen zeigt keine der eingesetzten Biokatalysatoren das Vermögen beide Ketofunktionen zu reduzieren. In allen Fällen stellt das Hydroxyketon das einzige Produkt der Reaktion dar. Tabelle 6. Umsetzung von Diketonen Substrat Enzym Dion (%) Hydroxyketon (%) Diol (%) YGL039w 97,05 2,43 <0,01 2,4-Pentandion YDL124w 92,57 6,64 <0,01 YL151w 95,26 3,99 <0,01 YDR368w 79,63 19,29 <0,01 YGL039w 75,90 19,60 <0,01 3,5-Heptandion YDL124w 49,90 47,10 <0,01 YL151w 71,40 23,70 <0,01 YDR368w 50,10 48,00 <0,01 YGL039w 97,30 <0,01 <0,01 3,6-ctandion YDL124w 98,47 <0,01 <0,01 YL151w 96,27 <0,01 <0,01 YDR368w 99,51 <0,01 <0,01 Zwei Verbindungen von besonderem kommerziellem Interesse sind 2,3-Butandiol und 4-Hydroxy-2-pentanon. Aus diesem Grund wurden erneute Umsetzungen durchgeführt, um diese Verbindungen zu erhalten. Als Katalysator wurde Ydr368wp verwendet, da dieser in den vorhergehenden Untersuchungen die besten Ergebnisse bei der Umsetzung von 2,3-Butandion und 2,4-Pentandion zeigte. Die Versuche wurden wiederum im Kleinmaßstab durchgeführt (Tabelle 7). Die Versuche zeigen, dass sich sowohl 2,3-Butandiol als auch 5-Hydroxy-2-pentanon mit Hilfe der Ydr368wp synthetisieren lassen. Vor allem die Ergebnisse zum 5-Hydroxy-2-pentanon sind viel versprechend, da bei der Reaktion sowohl ein sehr hoher Umsatz als auch ein exzellenter Enantiomerenüberschuss erzielt werden konnte. Die Selektivität der Umsetzung kann überdies durch geeignete Wahl der Glucosekonzentration gesteigert werden. Mit Hilfe von gaschromatographischen Messungen konnte nachgewiesen werden, dass das enantiomerenrein generierte 5-Hydroxy-2-pentanon (S)-konfiguriert ist. Für das mittels der genannten Enzyme hergestellte 2,3-Butandiol konnte die (S,S)- Konfiguration nachgewiesen werden. Das intermediär anfallende Acetoin racemisiert und liegt deshalb als Racemat in der Reaktionslösung vor

27 Ergebnisse Gesteuert durch die Nachfrage am Markt hat sich Julich Chiral Solutions auf die Synthesen der Diole konzentriert. Mittlerweile konnten für jeweils beide Enantiomere von 2,3-Butandiol, 2,5-Pentandiol, 3,5-Heptandiol und 3,6-ctandiol Syntheseprozesse mit isolierten Enzymen etabliert werden. Diese erlauben eine effiziente Herstellung der Verbindungen im Kilogramm-Maßstab und sind nach entsprechender Modifizierung auch im Tonnen-Maßstab durchführbar. Teilweise wurde bei diesen Prozessen allerdings auf die in diesem Projekt entwickelten Techniken zurückgegriffen, während die verwendeten Enzyme aus neuen rganismen stammen. Tabelle 7. Umsetzung von 2,3-Butandion und 2,4-Pentandion mit Ydr368wp Substrat 2,3-Butandion 2,4-Pentandion Substrat (mm) ADH (U/ml) Glucose (mm) Dion (%) Hydroxyketon (%) ee (%) Diol (%) ee/de (%) a) b) 0.8 -/- b) a) 46 - b) / a) a) nicht nachweisbar b) nicht bestimmt (s. Text) 4.5 -/- b) 0.4 -/- b) 3.9 Enzymatische Synthese mit Dehydrogenasen alternativer Mikroorganismen Biokatalytische Synthese der Enantiomere des 2,5-Hexandiols Die aus S. cerevisiae erfolgreich isolierte HDR kann zur Gewinnung von 3 aus 1 dienen. Wichtige Punkte in dieser Hinsicht sind die Effizienz der Kofaktorregenerierung und die Verfügbarkeit des Enzyms. Da die Kofaktorregenerierung im Fall der HDR aus S. cerevisiae einem Hilfsenzym bedarf, wurde nach Dehydrogenasen gesucht welche sowohl die Reduktion von 1 3 als auch die Kofaktorregenerierung katalysieren können. Getestet wurden ADH-LB aus Lactobacillus brevis und ADH-T aus Thermoanaerobacter spec., welche beide in der Lage sind unter den gleichen Bedingungen sowohl die Reduktion von 1 3 als auch die xidation des Wasserstoffdonators (hier 2-Propanol) zu katalysieren

28 Ergebnisse Die Gleichgewichtslage der enzymkatalysierten Reduktion von Diketonen kann zu Gunsten des Diols durch Entfernung des, bei der Kofaktorregenerierung gebildeten, xidationsproduktes aus der Reaktionsmischung beeinflusst werden. Wenn für die Kofaktorregenerierung (hier NADPH) 2-Propanol eingesetzt wird, so kann das, bei der Umsetzung entstandene, Aceton als niedrigst siedende Komponente abdestilliert werden, was unter fortlaufender xidation von 2-Propanol, die weitere bzw. vollständige Reduktion des eingesetzten Diketons zum finalen Diol ermöglicht. Am Beispiel von 1 wurde anhand des isolierten Enzyms ADH-LB bzw. ADH-T demonstriert, wie durch die Prozeßführung mit wiederholter Acetonentfernung die vollständige stereoselektive Biotransformation beider Ketogruppen eines Moleküls zu chiralen Alkoholfunktionen möglich ist (Abbildung 5). hne das Entfernen von Aceton aus der Reaktionsmischung kam die weitere Umsetzung des Zwischenproduktes 2 nach Erreichen eines Grenzwertes von ca. 75 g/l Aceton bei ca. 0,4 mol/l zum Erliegen. Der vollständige Umsatz zu 3 gelang durch destillatives Entfernen (35 C, mbar) von Aceton aus der Mischung, wobei der Verlust an 2-Propanol teilweise durch frischen Alkohol ausgeglichen wurde. Sofern der Gehalt an Aceton < 5% lag, konnte 2-Propanol aus den Destillaten rückgeführt und wieder eingesetzt werden. CH 3 H 3 C 1 ADH-T NADPH +2 iprh - Aceton (S) CH 3 H 3 C H (S)-2 ADH-T NADPH +2 iprh - Aceton H (S) CH 3 H 3 C (S) (S,S)-3 H CH 3 H 3 C 1 ADH-LB NADPH +2 iprh - Aceton (R) CH 3 H 3 C (R)-2 H ADH-LB NADPH +2 iprh - Aceton H (R) CH 3 H 3 C (R) (R,R)-3 H Abbildung 5: Biotransformation von 1 zu den enantiomeren Diolen (S,S)-3 und (R,R)-3. Aufgrund der guten Wasserlöslichkeit der Diole war eine Extraktion mit gängigen organischen Lösemittel wie MTBE nur begrenzt geeignet und die Ausbeuteverluste für eine profitable Prozessführung zu hoch (ca % d.th.). Daher wurde eine Produktisolierung mittels Kristallisation entwickelt. Das wässrige Reaktionsgemisch wurde nach Erreichen des maximalen Diolanteils (> 95 %) zunächst destillativ von Aceton, 2-Propanol und Wasser befreit. Der verbleibende zähe Rückstand wird mit heißem Ethylacetat versetzt, wobei der chirale Alkohol in Lösung geht. Nach Phasense