Konzentrationsabhängige funktionelle Hemmung der sauren Sphingomyelinase durch Antidepressiva

Transkript

1 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Universitätsklinikum Erlangen Psychiatrische und Psychotherapeutische Klinik Direktor: Prof. Dr. Johannes Kornhuber Konzentrationsabhängige funktionelle Hemmung der sauren Sphingomyelinase durch Antidepressiva Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt von Sven Städtler aus Kulmbach

2 Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen Nürnberg Dekan: Referent: Korreferent: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler Prof. Dr. med. Johannes Kornhuber PD Dr. med. Juan Manuel Maler Tag der Mündlichen Prüfung: 30. März 2011

3 Meinen Eltern gewidmet

4 Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung Hintergrund und Ziele Material und Methode Ergebnisse Schlussfolgerungen Abstract Background and Aims Materials and Methods Results Conclusion Sphingolipide als Teil der Zellmembran Sphingomyelinasen Die saure Sphingomyelinase Eigenschaften ASM-Hemmung über zellbiologische Mechanismen Pharmakologische Hemmung der ASM Die ASM generiert das bioaktive Lipid Ceramid Dysregulierte ASM-Aktivität bei unterschiedlichen Krankheiten Reduzierte ASM-Aktivität als Ursache der NPD Tumorerkrankungen zeigen erniedrigte ASM-Aktivität Arteriosklerose Diabetes mellitus Wilson-Krankheit Infektionen Endotoxischer Schock und Inflammation Emphysem und Cystische Fibrose Neuropsychiatrische Krankheitsbilder: Depression, Alzheimer, Apoplex Ziele der Arbeit Material und Methoden Material Eukaryote Zellen Puffer und Lösungen... 24

5 7.1.3 Verwendete Wirkstoffe Methoden Zellkultur Proteinkonzentrationsbestimmung Bestimmung der ASM-Aktivität Statistische Auswertung Ergebnisse Antidepressiva unterschiedlichster Klassen hemmen die ASM Trizyklische Antidepressiva Amitriptylin Desipramin Clomipramin Tetrazyklische Antidepressiva Mianserin Maprotilin Selektive-Serotonin-Wiederaufnahme-Hemmer Sertralin Paroxetin Fluoxetin Citalopram Alaproclate Selektive-Noradrenalin-Wiederaufnahme-Inhibitoren (NRI) - Reboxetin Noradrenalin- und selektiver Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (NaSSA) Mirtazapin Diskussion ASM-Inhibtoren finden sich in den unterschiedlichsten Antidepressiva- Klassen Bewertung der Ergebnisse Lysosomotropismus als mögliche Erklärung der klinischen Latenz von Antidepressiva Therapeutische Konzentrationen von Antidepressiva hemmen ASM ohne pathologisch zu niedrige ASM-Restaktivität zu erzeugen Spezifische Hemmung der ASM durch therapeutische Konzentrationen Antidepressiva ASM-Hemmung ist bei vielen Krankheitsbildern von Vorteil... 56

6 9.7 Die verwendeten Antidepressiva hemmen die sekretierte Form der ASM nicht Vorteile und Limitationen des verwendeten Zellkulturmodells Die Chance der erweiterten klinischen Anwendung der ASM-hemmenden Antidepressiva Literaturverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Anhang Chemikalien Hilfsmittel Geräte und Apparaturen Kommerziell erhältliche Systeme Danksagung... 75

7 7 1 Zusammenfassung 1.1 Hintergrund und Ziele Die saure Sphingomyelinase (ASM) nimmt eine entscheidende Rolle im Sphingolipidstoffwechsel ein, indem sie die Hydrolyse von Sphingomyelin zu Ceramid und Phosphorylcholin katalysiert. Hierrüber ist die ASM am normalen Zellmembranumsatz beteiligt und reguliert über ihr Reaktionsprodukt, dem bioaktiven Lipid Ceramid, intrazelluläre Signalkaskaden. Initiiert werden diese Signalkaskaden durch diverse Stressstimuli, die zu einer Aktivitätssteigerung der ASM führen und somit eine erhöhte Produktion an Ceramid verursachen. Ceramid stellt ein bioaktives Lipid dar und ist in der Lage Apoptose zu induzieren. Liegt, wie bei ASM knock-out Mäusen, ein Defizit der ASM vor, so bewirkt dies unter zellulären Stressbedingungen einen Schutz des Gewebes vor Apoptose. Darüber hinaus findet sich bei einer Vielzahl von Krankheitsbildern eine dysregulierte, meist jedoch erhöhte Aktivität der ASM. Wie seit längerem bekannt sind kationisch amphiphile Substanzen (KAS) wie Antidepressiva in der Lage die Aktivität der sauren Sphingomyelinase zu inhibieren. KAS induzieren eine Verdrängung der ASM von der inneren Lysosomenmembran, was zu einer Inaktivierung der ASM führt und sie somit funktionell inhibiert. Kationisch amphiphile Substanzen, die die ASM funktionell inhibieren bezeichnet man als FIASMAs (Functional Inhibitor of Acid SphingoMyelinAse). Die Inhibition der ASM wurde in vorausgehenden Studien allerdings mit Substanzkonzentrationen gemessen, die um ein Vielfaches über den Konzentrationen lagen, die im Plasma von Patienten unter Antidepressivatherapie vorliegen. Somit war Ziel dieser Arbeit den Einfluss von Antidepressiva unterschiedlichster Klassen auf die saure Sphingomyelinase zu untersuchen und das im therapeutisch relevanten Plasmakonzentrationsbereich. 1.2 Material und Methode Die Hemmung der ASM durch Antidepressiva in deren therapeutisch relevanten Konzentrationsbereichen wurde in vitro durch ein gut etabliertes Zellkulturmodell gemessen. In diesem Zellkulturmodell wurde eine Glioblastomzelllinie (H4) für 24 Stunden mit therapeutisch relevanten Konzentrationen gebräuchlicher Antidepressiva inkubiert. Anschließend wurden die Zellen geerntet, Proteinlysate erstellt und die Proteinkonzentration der erhaltenen Lysate bestimmt. Die Ermittlung der ASM-Aktivität erfolgte durch

8 8 einen spezifischen Enzym-Aktivitätsassay. Die Enzymaktivität wurde auf die jeweils mitgeführte unbehandelte Kontrolle bezogen und in Prozent angegeben. Ausgewertet wurden die erhobenen Werte mittels Origin in einer Logistic dose response Funktion. 1.3 Ergebnisse Unter den verwendeten Antidepressiva zeigten Reboxetin, Alaproclate und Mirtazapin keinen eindeutigen hemmenden Einfluss auf die ASM. Im therapeutischen Plasmakonzentrationsbereich waren Amitriptylin, Desipramin, Clomipramin, Maprotilin und Fluoxetin in der Lage die saure Sphingomyelinase zu inhibieren. Die restlichen verwendeten Antidepressiva mit Mianserin, Sertralin, Paroxetin und Citalopram erreichten zwar eine Hemmung der ASM, diese allerdings bei Konzentrationswerten, die über den therapeutisch empfohlenen Plasmaspiegeln liegen. 1.4 Schlussfolgerungen Die Ergebnisse verdeutlichen, dass FIASMAs, die in vitro bei sehr hohen Wirkstoffkonzentrationen die ASM hemmen, in therapeutisch relevanten Konzentrationsbereichen nicht zwangsläufig die Aktivität dieses Enzyms inhibieren. Die Identifikation von ASM-Inhibitoren, die auch in therapeutischen Konzentrationen effektiv und bereits als Medikament zugelassen sind, ermöglicht jedoch eine unkomplizierte und schnelle Aufnahme dieser Substanzen zur Evaluation für eine erweiterte klinische Anwendung.

9 9 2 Abstract 2.1 Background and Aims Acid Sphingomyelinase (ASM) plays an important role in sphingolipid catabolism, catalyzing the hydrolysis of sphingomyelin to ceramide and phosphorycholine. Thus ASM participates in normal membrane turnover and regulates ceramide-mediated intracellular signal transduction. ASM activity is increased by various stress stimuli and raises cellular ceramide concentrations. Ceramid is a bioactive lipid and induces apoptosis. ASM knock-out mice, which are characterized by a genetic deficiency in ASM activity, are resistant to stress-induced apoptosis. Additionally, increased ASM-activity is present in many common. Cationic amphiphile drugs, such as antidepressants, are potent inhibitors of ASM. Cationic amphiphile drugs inhibit ASM, which induces a detachment of ASM protein from inner lysosomale menbranes causing successive inactivation. These Inhibitors of ASM, which functional inhibit ASM are named FIASMAs (Functional Inhibitor of Acid SphingoMyelinAse). The inhibitory effect was shown for extreme drug concentrations, which were above the recommended therapeutic range of plasma concentration present in patients undergoing antidepressant therapy. The purpose of this work was to explore the effect of antidepressants within their recommended therapeutic range of concentration on ASM activity. 2.2 Materials and Methods The inhibition of ASM-activity by antidepressants in their recommended therapeutic range was measured in vitro in a well-established cell-culture-model. In this model human brain neuroglioma H4 cells were incubated for 24 hours with antidepressants in their recommended therapeutic concentrations. The activity of ASM was determined in whole-cell lysates and measured in a specific enzyme-activity-assay. The enzymeactivity was measured by percent comparing to the untreated control. The results were analyzed using a dose-response function. 2.3 Results No ASM-inhibiting effect was identified for reboxetine, alaproclate and mirtazapin. Amitriptylin, desipramine, clomipramine, maprotiline and fluoxetine were able to reduce the activity of ASM in their recommended therapeutic range of concentration. The antidepressants mianserine, sertraline, paroxetine and citalopram were also able to re-

10 10 duce the activity of ASM, but with concentrations that were slightly above the recommended plasma range. 2.4 Conclusion The results demonstrate that FIASMAs which reduce ASM activity in vitro at very high concentrations do not necessarily inhibit ASM in therapeutic recommended plasma concentrations. The identification of ASM-inhibitors, which are effective in therapeutic concentrations and are already approved in clinical use, may offer the opportunity of an uncomplicated and quick evaluation of these substances for further medical use.

11 11 3 Sphingolipide als Teil der Zellmembran Das fluid-mosaic-model der Zellmembran aus den 1970er Jahren deutete darauf hin, dass Zellmembranen in einem Zustand des stetigen Wandels und der Unordnung vorliegen [102]. In den folgenden Jahren konnte dieses Modell durch das Konstrukt der microdomains ergänzt werden. Diese Bereiche inmitten der Zellmembran besitzen die Fähigkeit sich abhängig von diversen Stimuli zusammen zu lagern beziehungsweise zu reorganisieren [55]. Mit Sphingolipiden und Cholesterol angereicherte microdomains werden als lipid rafts bezeichnet und spielen eine wesentliche Rolle in der Funktion der Zellmembran [3, 101]. Sphingolipide wie Sphingomyelin sind entscheidende Komponenten aller Lipidmembranen des menschlichen Körpers. Vor allem als Membranlipide im Nervensystem spielen sie eine wichtige Rolle. 4 Sphingomyelinasen Sphingomyelinasen sind Enzyme, die die Hydrolyse von Sphingomyelin in Ceramid und Phosphorylcholin katalysieren [5]. Abbildung 1: Sphingomyelinase: Hydrolyse von Sphingomyelin zu Phosphorylcholin und Ceramid Das menschliche Erbgut kodiert für unterschiedliche Sphingomyelinasen, die sich in ihrem ph-optimum unterscheiden. Die neutrale Sphingomyelinase besitzt ihr ph- Optimum nahe 7 und findet sich in allen Zellen des menschlichen Körpers, wobei sich die höchste Aktivität der neutralen Sphingomyelinase im Gehirn nachweisen lässt [29]. Die zweite Form stellt die alkalische Sphingomyelinase dar, die ihre optimale Aktivität bei einem ph-wert von 9-9,5 hat und ausschließlich im Darm exprimiert wird [12].

12 12 Vervollständigt wird die Gruppe durch die saure Sphingomyelinase (ASM), deren ph- Optimum bei einem ph-wert von 5 liegt [5]. Die ASM ist in allen Zellen zu finden und wird durch zelluläre Stressbedingungen aktiviert. Die Tatsache, dass die ASM extensiv durch zelluläre Stresssignale in ihrer Aktivität reguliert wird zeigt, dass die pharmakologische Regulation dieses Enzyms ein interessantes Forschungsgebiet darstellt [29]. 4.1 Die saure Sphingomyelinase Die ASM wurde somit das am intensivsten beforschte Enzym dieser Gruppe. Erste Hinweise auf die Existenz eines solchen Enzyms ergaben sich bereits im Jahre 1938 [110] Eigenschaften Das Gen der sauren Sphingomyelin-Phosphodiesterase (SMPD1), was auf Chromosom 11p15.1-p15.4 lokalisiert ist, kodiert für die ASM [97]. SMPD1 liegt als imprintetes Gen vor und wird vorzugsweise vom maternalen Chromosom exprimiert, was als Form der Regulation typisch für Gene ist, welche eine entscheidende Rolle in der Entwicklung spielen [87]. Neben der lysosomalen, enzymatisch aktiven Form existieren eine sekretorische und eine zytoplasmatische Form der ASM, die durch Spleißen, posttranslationale Modifikation und alternative zelluläre Transportmechanismen generiert werden [56] ASM-Hemmung über zellbiologische Mechanismen Die saure Sphingomyelinase stellt ein stark reguliertes Enzym dar und kann über diverse zellbiologische Mechanismen in ihrer Aktivität beeinflusst werden. Beispiele hierfür sind transkriptionelle und posttranslationale Modifikationen sowie regulatorische Faktoren, wie zum Beispiel der ph-wert, Sphingolipid-Aktivator-Proteine (SAP), Tumorsuppressor-Gen p53 oder auch lysosomale Lipide wie Diacylglycerol oder Phosphatidylinositol [56] Pharmakologische Hemmung der ASM Neben diesen zellbiologische Mechanismen der ASM-Hemmung spielt die pharmakologische Intervention und damit Hemmung der ASM eine entscheidende Rolle. Medikamente aus unterschiedlichsten pharmakologischen Klassen vermögen eine Inhibition der ASM zu berwirken. Darunter finden sich neben Antidepressiva Neuroleptika, Anti-

13 13 histaminika, Medikamente gegen Bluthochdruck, Angina pectoris oder auch funktionelle gastrointestinale Beschwerden, Muskelrelaxanzien oder auch Hustenstopper [64] Kationisch amphiphile Substanzen Kationisch amphiphile Substanzen (KAS) sind in vielen interessanten therapeutischen Substanzklassen vertreten. Die Klasse der Antidepressiva zeigt hierbei einen überproportional hohen Anteil an KAS. Die KAS, die schwache organische Basen darstellen, sind charakterisiert durch ein hohes Verteilungsvolumen im Körper und ihre Eigenschaft sich in sauren Kompartimenten der Zelle (z.b. Lysosomen) zu konzentrieren [72]. Als chemische Gemeinsamkeit besitzen KAS ein hydrophobes Strukturelement sowie eine hydrophile Seitenkette mit einer kationisch geladenen Amingruppe [43]. Neben der sauren Sphingomyelinase hemmen kationisch amphiphile Substanzen, wie Antidepressiva, weitere lysosomale Enzyme [61, 116]. Dieser unspezifische funktionelle Mechanismus wird im Folgenden näher erläutert pk a und log P als entscheidende Substanzeigenschaften Bisherige Untersuchungen zeigten, dass für die Hemmung der ASM vor allem der log P sowie der pk a als Substanzeigenschaften der kationisch amphiphilen Substanzen eine entscheidende Rolle spielen. Bezüglich des log P ist darüber hinaus eine Korrelation zwischen der Akkumulation der KAS und ihrem log P-Wert gezeigt [54]. Der log P-Wert lässt eine Aussage zu, ob eine Substanz liphophile oder hydrophile Eigenschaften besitzt. Ist der log P positiv, so zeigt die Substanz bessere Lösungseigenschaften in Octanol und ist somit lipophil. Besitzt eine Substanz negative Werte als log P, so ist sie hydrophil. Antidepressiva zeigen aufgrund ihres positiven log P überwiegend lipophile Substanzeigenschaften. Der pk a entspricht dem negativen dekadischen Logarithmus der Säurekonstante K a, die eine Stoffkonstante darstellt, welche aufzeigt in welchem Maß ein Stoff in einer Gleichgewichtsreaktion mit Wasser unter Proteolyse reagiert. Entspricht in einer Gleichgewichtsreaktion der pk a dem ph-wert, so liegen die Säure und die korrespondierende Base im Verhältnis 1:1 vor. Die pk a -Werte der meisten Antidepressiva liegen über dem Wert von 8, was bedeutet, dass im sauren Milieu, wie zum Beispiel intralysosomal, überwiegend die protonierte Form, das heißt die Säure vorliegt. Frühere Studien konnten zeigen, dass ein Zusammenhang zwischen den Substanzeigenschaften, wie pk a und log P, und der Hemmwirkung der jeweiligen Substanz besteht

14 14 [64]. Eine hemmende Eigenschaft auf die Aktivität zeigen demnach vor allem Substanzen, deren pk a 8 und der log P 3 sind [Abbildung 2]. Dies macht deutlich, dass lipophile (positiver log P) Substanzen, die im sauren Milieu als protonierte Säuren (hoher pk a ) vorliegen vor allem in der Lage sind die Aktivität der ASM zu inhibieren. Abbildung 2: pk a -log P-Diagramm Anhand ihrer pk a - und log P-Werte sind 38 Substanzen aufgetragen. Eine Hemmwirkung (Aktiv) wurde charakterisiert durch eine mindestens 50%ige Inhibition der ASM nach einer Inkubation von 24 Stunden im H4-Zellkulturmodell mit einer Substanzkonzentration von 10 µm. Modifiziert nach [64] Die ASM wird funktionell gehemmt Der für die hemmende Wirkung der Antidepressiva auf die lysosomale ASM entscheidende Regulationsmechanismus erfolgt mittels Degradation. Wie bereits seit Mitte der 80er Jahre bekannt, hemmen trizyklische Antidepressiva wie Desipramin oder Imipramin die zelluläre Aktivität der ASM [2]. Grundlegend für diese Hemmung ist der saure intralysosomal ph-wert, der durch eine ATP-abhängige Protonenpumpe aufrecht erhalten wird. Kationisch amphiphile Substanzen wie Antidepressiva können aufgrund ihrer Lipophilie (positiver log P) frei über Lipidmembranen diffundieren. Nachdem sie im Inneren des Lysosoms bei saurem ph protoniert wurden, verlieren sie diese Eigenschaft (pk a im basischen). Dies wird als Lysosomotropismus bezeichnet [19]. Die kumulierten, protonierten Basen interferieren mit den ionischen Wechselwirkungen der ASM zur Lysosomenmembran und führen zu

15 15 einer Verdrängung [59] mit anschließender proteolytischer Spaltung und damit Inaktivierung des Enzyms [52]. Kationisch amphiphile Substanzen wie Antidepressiva hemmen die ASM somit nicht spezifisch durch kompetitive beziehungsweise allosterische Mechanismen, sondern funktionell [Abbildung 3]. KAS, die die ASM funktionell inhibieren bezeichnet man als FIASMAs (Functional Inhibitor of Acid SphingoMyelinAse) [63]. Abbildung 3: Funktionelle Inhibition der ASM durch intralysosomal kumulierende schwache organische Basen. Schwache organische Basen (B) kumulieren in sauren intrazellulären Kompartimenten (1), da die lysosomale Membran für die protonierte Base (BH + ) weniger permeabel ist als für die unprotonierte Base (B). Dieses Phänomen wird als Lysosomotropismus bezeichnet. Hohe Konzentrationen protonierter Basen stören die Bindung der ASM zur inneren Lysosomenmembran und bewirken somit eine Verdrängung der ASM von der Membran (3). Infolgedessen erfolg die proteolytische Spaltung und damit Inaktivierung der ASM (4) [64]. 4.2 Die ASM generiert das bioaktive Lipid Ceramid Für den Umsatz von Sphingomyelin ist die saure Sphingomyelinase verantwortlich. Sie katalysiert den Abbau von Sphingomyelin in Phosphorycholin und Ceramid [103]. Ceramid stellt wiederrum ein bioaktives Lipid dar. Ceramid induziert Apoptose, indem es die Bündelung von CD95 (cluster of differetiation 95) Rezeptoren auslöst. Dementsprechend führt eine Aktivierung der ASM und die daraus resultierende Ceramidproduktion zu Apoptose [39]. Stressstimuli wie Bestrahlung, Hitzeschock oder auch UV-Licht induzieren eine Aktivitätssteigerung der ASM und führen mit dem damit vermehrt produziertem Ceramid, als bioaktives Lipid, zur Apoptoseinduktion [40]. Wichtig in diesem

16 16 Zusammenhang ist die Entdeckung der Translokation der ASM von ursprünglich lysosomaler beziehungsweise endosomaler Lage, hin zur Außenseite der Zelloberfläche nach unterschiedlichsten Stressstimuli auf die Zelle [35, 112]. Eine Erklärung für die Translokation der ASM erbrachte ein Modell in dem beobachtet wurde, dass Proteinkinase C-delta (PKCδ) unter UV-Stress die ASM an einem spezifischen Serin-Rest phosphoryliert. Diese Phosphorylierung führt hier zur Translokation der ASM und einer verbesserten Funktion im physiologischen ph [122]. Durch Forschungsarbeiten an ASM knock-out Mäusen (ASMKO) wurde beobachtet, dass bei einem Defizit an ASM in unterschiedliche Zelltypen eine Stresseinwirkung auf die Zelle nicht wie gewöhnlich mit einer Aktivierung der ASM und vermehrten Produktion von Ceramid einhergeht und damit das Gewebe vor Apoptose geschützt wurde. Unter den zellulären Stressstimuli, die eine ASM-Aktivierung hervorrufen konnten sind zu nennen: Ionisierende Strahlung [92] sowie Photodynamische Therapie [99] bei human Lymphoblasten, Lipopolysaccharide (LPS) [41] und Cisplatin [86] bei Endothelzellen, Ischämie/Reperfusions-Schäden [70], Fas- [69] und TNF-α-induzierte Apoptose bei Hepatozyten. Darüberhinaus zeigten ASMKO im Vergleich zu Wild-Typ Mäusen einen Schutz gegen T-Zell-induzierte Apoptose von Hepatozyten [58]. 5 Dysregulierte ASM-Aktivität bei unterschiedlichen Krankheiten Nachdem die ASM durch unterschiedliche zelluläre Stressbedingungen aktiviert werden kann und die Produkte, der ASM katalysierten Reaktion, Apoptose auslösen können, ist es nicht verwunderlich, dass eine dysregulierte, meist erhöhte ASM-Aktivität in verschiedenen Krankheitsbildern beobachtet wird. Ob die erhöhte ASM-Aktivität die Ursache oder die Konsequenz der Pathologie darstellt ist bisher in den wenigsten Fällen geklärt. Dennoch ist die pharmakologische, funktionelle Hemmung der ASM von großem Nutzen und könnte eine erhöhte ASM-Aktivität verhindern helfen, selbst wenn die ASM-Aktivität nicht kausal für die Erkrankung ist. 5.1 Reduzierte ASM-Aktivität als Ursache der NPD Im Jahre 1914 beschrieb der deutsche Pädiater Albert Niemann erstmals einen Patienten, der an der Niemann-Pick-Krankheit (NPD) litt. Diese Erkrankung beruht auf einer fehlerhaften lysosomalen Lipid-Anreicherung. 20 Jahre später wurde diese bei Patienten beobachtete Lipid-Anreicherung auf Sphingomyelin zurückgeführt [10, 14]. Wie man heute weiß kommt es neben der pathologischen Speicherung von Sphingomyelin auch

17 17 zur Anreicherung anderer Lipide, wie Cholesterol oder Gangliosiden, was zu diversen zellulären Fehlfunktionen führt [93]. Als Ursache für die seltene, autosomal-rezessiv vererbte, lysosomale Speicherkrankheit Niemann-Pick (Typ A und B) ist eine Mutation im SMPD1 Gen, das für die saurer Sphingomyelinase kodiert, anzusehen. Dies führt zu einer verminderten Aktivität der ASM [10, 96]. Es sind zwei Typen der Niemann-Pick-Krankheit bekannt. Der Typ A der Niemann- Pick-Erkrankung stellt die infantile Form der Erkrankung dar und ist klinisch gekennzeichnet durch einen schnellen, progressiven Krankheitsverlauf, der im Alter von zwei bis drei Jahren zum Tode führt. Im Gegensatz dazu, kommt es beim Typ B der NPD zu einem späteren Auftreten der Erkrankung, bei dem die Patienten von wenigen bis keinen neurologischen Symptomen, bis hin zu ernst zu nehmenden und fortschreitenden Beteiligungen innerer Organe, wie Hepatosplenomegalie, pulmonale Insuffizienz oder kardiovaskuläre Auffälligkeiten, aufweisen können [71]. Es kommt desweiteren zu unterschiedlichen Ausprägungen des klinischen Erscheinungsbildes des Typ A und B der NPD, was abhängig von Unterschieden in der Restaktivität der ASM ist. Die Restaktivität beträgt dabei beim Typ A lediglich 0,15% der normalen Aktivität, beim Typ B sind es immerhin noch 4% [32]. Während die meisten klinischen Auffälligkeiten der NPD mit Lipid-Speicherungen in Lysosomen und/oder Endosomen erklärt werden können, deuten aktuelle Studien darauf hin, dass die Fehlfunktion der sauren Sphingomyelinase an der Oberfläche der Zellmembran, die einen wichtigen Beitrag zur Formation und Funktion der Zellmembran leistet, ebenfalls einen Teil der Pathophysiologie der Niemann-Pick-Krankheit erklären kann [39, 93]. Eine Studie an ASMKO Mäusen hat in diesem Zusammenhang zeigen können, dass es aufgrund der Akkumulation von Sphingolipiden, die dem ASM-Defizit geschuldet ist, zu einer Reduktion der Fluidität der Zellmembran kommt [93]. 5.2 Tumorerkrankungen zeigen erniedrigte ASM-Aktivität Tumore zeichnen sich im Vergleich zu gesundem Gewebe durch eine erhöhte Proliferation und reduzierte Apoptose aus. Bezogen auf die reduzierte Apoptose ist die Tatsache bemerkenswert, dass Tumoren wie das Kolonkarzinom [98], Gliome [88] oder auch Ovarialkarzinome [91] signifikant erniedrigte Level an Ceramid, einem Mediator für den programmierten Zelltod, aufweisen. Ceramid ist wie bereits erwähnt das Reaktionsprodukt der ASM, was auf eine erniedrigte Aktivität der ASM im klinischen Bereich der Tumoren schließen lässt.

18 18 Ceramid und somit auch die ASM spielen darüberhinaus eine wichtige Rolle in der Antwort von Tumorzellen auf unterschiedlichste Chemotherapeutika. Bei einem mit Cisplatin behandelten Kolonkarzinom fiel auf, dass es zu einer Aktivierung der ASM sowie einer vermehrten Produktion von Ceramid mit daraus folgender Apoptose kommt. Durch eine Hemmung der ASM mittels Imipramin konnte die Cisplatininduzierte Apoptose reduziert werden [66]. Ähnliche Beobachtungen zeigten sich bei Ovarialkarzinomen, welche mit Paclitaxel, einem Mitose-Hemmstoff, behandelt wurden. Die bei Paclitaxel-Behandlung beobachtete Apoptose ist von Ceramid abhängig und Paclitaxel-resistente Tumoren sind durch eine erniedrigte Bildung an Ceramid gekennzeichnet [84]. Dies unterstreicht die Rolle der ASM in der chemotherapeutisch induzierten Apoptose. Neuere Studien ergaben, dass eine Transfektion humaner Gliomzellen mit ASM cdns zu einer Sensibilisierung dieser Tumorzellen für Chemotherapien mit Doxorubicin oder Gemcitabin führen. Diese Sensibilisierung beruht auf der erhöhten ASM-Aktivität verbunden mit einem Mehr an Ceramid, welches Apoptose induziert. Gleichzeitig ist davon auszugehen, dass Doxorubicin und Gemcitabin über eine Aktivierung der ASM ihre chemotherapeutische Wirkung entfalten [33]. Hier zeigt sich die Möglichkeit einer Sensibilisierung von Tumoren über eine Aktivitätssteigerung der ASM, was eine interessante Behandlungsweise von Tumoren darstellen könnte. Bemerkenswert bleibt schließlich die Beteiligung der ASM bei toxischen Nebeneffekten der Tumortherapie, wie einem Gastrointestinalen-Syndrom nach Strahlentherapie [27] oder auch einer möglichen Sterilität nach Doxorubizin-Therapie [76]. Hier bleibt abzuwarten, ob eine spezifische Hemmung der ASM toxische Nebeneffekte einer Chemotherapie in gesunden Zellen minimieren hilft. 5.3 Arteriosklerose Erste Hinweise auf einen Einfluss der sauren Sphingomyelinase in die Pathogenese der Arteriosklerose ergaben sich, als Kinder mit NPD (Typ A & B) Auffälligkeiten in ihren Blutfettprofilen zeigten, was in diesem Alter untypisch ist [74]. Eine mögliche Erklärung hierfür bietet ein Konzept, das auf der sekretorischen Form der ASM (S-SMase) beruht [107]. Dieses Enzym, dessen Aktivität abhängig von Zink ist und im Zellplasma sowie im Endothel vorhanden ist, besitzt die Fähigkeit das in low-density lipoprotein (LDL) vorhandene Sphingomyelin, selbst bei einem ph-wert von 7,5, der deutlich über denen intralysosomal liegt, zu spalten. Dies führt zu einer vermehrten Aggregation der

19 19 LDL-Partikel im Subendothel, bedingt durch ihre erhöhte Affinität zueinander [94, 108]. Aggregierte LDL-Partikel rekrutieren Gewebemakrophagen, welche sich nach einer Zeit in Schaumzellen umwandeln. Diese nehmen über diverse Mechanismen Einfluss auf die Pathogenese der Arteriosklerose [119]. Die Tatsache, dass sich in humanen arteriosklerotischen Läsionen Ceramid-angereicherte, aggregierte LDL-Partikel befindet, ist ebenfalls ein Indiz für die Beteiligung der S-SMase bei der Retention von Lipoproteinen in der extrazellulären subendothelialen Matrix [95]. Weitere Studien stellten einen Zusammenhang zwischen einem hohen Gehalt an Sphingomyelin in zirkulierenden Lipoproteinen und einem damit verbundenem erhöhtem KHK-Risiko beim Menschen heraus [53]. 5.4 Diabetes mellitus Diabetes mellitus, eine Stoffwechselkrankheit, die mit erhöhten Blutzuckerwerten einhergeht, stellt einen Risikofaktor für die Entwicklung einer Arteriosklerose dar. Studien ergaben hierzu, dass bei schlanken Typ-II Diabetikern die Aktivität der Zinkabhängigen, im Plasma vorhandenen ASM auf das Doppelte der Norm erhöht ist. Diese Tatsache verbunden mit der Rolle der ASM in der Pathogenese der Arteriosklerose könnten den Zusammenhang des erhöhten Risikos bei Diabetikern an Arteriosklerose zu erkranken erklären [31]. Die Skelettmuskulatur von Patienten mit Diabetes mellitus Typ II weist desweiteren erhöhte Level an Ceramid auf, welches über unterschiedlichste Mechanismen einen Beitrag an der bei Diabetikern beobachteten Insulinresistenz leisten soll [105]. Auf diesen Zusammenhang des Sphingomyelin-Stoffwechsels mit einer Insulin-Resistenz bezogen, zeigten Inkubationsversuche des Insulin-Rezeptor-Substrates (IRS-1) mit saurer Sphingomyelinase oder Ceramid eine Phosphorylierung des IRS-1. Dies führte zu einer Unterbrechung des Insulin-Signalweges am Rezeptor [50]. Somit stellt die ASM und ihre selektive Inhibition ein interessantes Gebiet für therapeutische Strategien zur Intervention der Entwicklung einer Arteriosklerose bei Typ-II Diabetikern und zur Behandlung der Insulin-Resistenz dar. 5.5 Wilson-Krankheit Die Wilson-Krankheit ist eine Speicherkrankheit bei der eine Mutation im ATP7B- Protein zu einer Akkumulation von Kupfer in vielen Organen, aber vor allem der Leber, führt. Kupfer wirkt dabei, wie andere Schwermetalle auch, zytotoxisch auf das Leber-

20 20 gewebe. Neben der Irritation des Leberstoffwechsels führt die Akkumulation von Kupfer auch zu Symptomen im kardialen, hämatopoetischen und auch nervalen System. In Studien konnte gezeigt werden, dass eine Exposition von Hepatozyten mit Kupfer die ASM aktiviert und die zelluläre Ceramidkonzentration erhöht. Durch die bioaktive Funktion des Ceramid wird schließlich Apoptose induziert. In vivo zeigten Patienten, die an der Wilson-Krankheit leiden, erhöhte ASM-Aktivität im Plasma. Hepatozyten aus ASMKO-Mäusen sowie humane HepG2 Zellen, deren ASM-Aktivität durch Amitriptylin oder ASM-spezifische sirna gehemmt wurde, wiesen einen Schutz gegenüber Kupfer-induzierter Apoptose auf. Schließlich bleibt noch ein Morbus-Wilson- Rattenmodell zu erwähnen, bei dem mittels pharmakologischer Inhibition der ASM, eine Leberzirrhose verhindert und ein erhöhtes Überleben gesichert werden konnte [68]. 5.6 Infektionen Ein Einfluss der sauren Sphingomyelinase wurde ebenfalls bei vielen Infektionen gezeigt, darunter Infektionen mit Staphylococcus aureus [23], Salmonella thyphimurium [73], Escherichia coli [24], Mycobacterien [115] und Pseudomonas aeruginosa [120]. Letzteres Bakterium hat besondere Auswirkungen auf Patienten mit systemischen Infektionen, Cystischer Fibrose oder beatmungs-assoziierten Pneumonien. Kommt es zu einer Infektion von Lungenepithel mit Pseudomonas aeruginosa, oder anderen Pathogenen, führt dies bei der ASM zu deren schneller Aktivierung und Translokation an den extrazellulären Anteil der Zellmembran [36]. Diese Aktivierung der sauren Sphingomyelinase an der Zellaußenseite führt zur Bildung von Ceramid-angereicherten rafts, welche entscheidend für die Aufnahme des Bakteriums in die Zelle, die Einleitung des Zelltodes sowie der schrittweisen Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen sind. Bei einer Infektion mit Neisseria gonorrhoe wurde ermittelt, dass durch eine sowohl pharmakologisch mittels Imipramin als auch genetisch (ASMKO-Mäuse) bewirkte Hemmung der ASM ein Eindringen von Neisseria gonorrhoe in Epithelzellen [34] und phagozytische Zellen verhindert werden kann. Bei der pharmakologischen Hemmung zeigte sich eine dosisabhängige Reduktion der Bakterieninvasion [47]. Eine Infektion menschlicher Epithelzellen mit pathologischen Rhinoviren wird ebenfalls über Ceramid-angereicherte rafts vermittelt und lässt sich durch genetische und pharmakologische Hemmung der ASM blocken [37].

21 21 Verschiedenste Pathogene lassen somit erahnen welch großen Einfluss die ASM in Verbindung mit ihrem Hydrolyseprodukt Ceramid in der Pathophysiologie von verschiedensten Infektionskrankheiten besitzt. 5.7 Endotoxischer Schock und Inflammation In Modellen zum Lipopolysaccahrid (LPS)-induzierten endotoxischem Schock konnte gezeigt werden, dass ASMKO Mäuse letale LPS-Dosen überleben [41]. Makrophagen benötigen zur LPS-induzierten Stressantwort eine Aktivierung des Toll-like Rezeptor 4 Komplexes (TLR4). Dieser Rezeptorkomplex benötigt wiederum Ceramidangereicherte microdomains, sogenannte lipid rafts, um sich aufzubauen. Das für die lipid rafts nötige Ceramid entstammt der Reaktion, die die ASM katalysiert. Somit besteht eine Verbindung zwischen der ASM-Aktivität und dem durch LPS induzierten Zellstress. Untermauert wird diese Tatsache durch die Möglichkeit, die Formierung des TLR4-Komplexes über eine pharmakologische Hemmung der ASM mittels Imipramin zu unterbinden. Desweiteren blockierte Imipramin eine LPS-induzierte Freisetzung von TNF-α [17]. ASMKO-Mäuse, welchen das SMPD1-Gen, das für die ASM kodiert, fehlt, zeigten erhöhte Überlebensraten bei endotoxischem Schock. Dies unterstreicht die Rolle der sauren Sphingomyelinase im Zusammenhang mit apoptotischem Zelltod [13]. 5.8 Emphysem und Cystische Fibrose Bei dem Endstadium vieler chronischer Lungenerkrankungen, dem Emphysem, was vor allem durch Zigarettenrauch verursacht wird, konnte gezeigt werden, dass Ceramid ein entscheidender Mediator für die alveolären Schädigung ist, die bei einem Lungenemphysem auftritt. Intratracheale Instillationen von Ceramid in Wild-Typ Mäuse verursachten eine Emphysembildung, während die Reduktion von Ceramid diese verhinderten. Auf den Menschen bezogen, finden sich bei rauchenden Emphysempatienten erhöhte Level an Ceramid im Lungengewebe [83]. Nicht nur bei der Pathophysiologie des Emphysems sondern auch in der der Cystischen Fibrose (CF) spielt die saure Sphingomyelinase eine Rolle. Bei Patienten mit CF sowie im Mausmodell weisen Studien darauf hin, dass in der Zellmembran der Lungengewebe erhöhte Level an Ceramid vorliegen. Desweiteren führte eine pharmakologische Hemmung der ASM mittels Amitriptylin zu einer Normalisierung der Ceramid Level und einem Schutz des Lungenepithels vor einer Infektion mit Pseudomonas aeruginosa [109]. Dieser Schutz vor einer Infektion mit Pseudomonas konnte bei CF-Mäusen auch

22 22 mittels einer Inhalation von ASM-Inhibitoren wie Amitriptylin, Desipramin, Fluoxetin aber auch Sertralin erreicht werden. Die Inhalation hatte dabei keine systemischen Effekte [8]. Darüber hinaus stellte die Anreicherung eines transmembranen Regulators (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator / CFTR) in rafts einen entscheidenden Faktor zur Abwehr einer Infektion mit Pseudomonas aeruginosa dar und fehlte CF-Patienten aufgrund ihres genetischen Defekts [65]. Eine klinische Studie an CF-Patienten konnte zeigen, dass bei drei von vier CF- Patienten eine 14-tägige Therapie mit Amitriptylin, im Vergleich zur Placebotherapie, zu einer signifikanten Verbesserung ihres forcierten endexspiratorischen 1-Sekunden- Volumens (FEV1) führte. Amitriptylin könnte somit eine sichere und effiziente Anwendung bei Patienten mit Cystischer Fibrose finden [90]. 5.9 Neuropsychiatrische Krankheitsbilder: Depression, Alzheimer, Apoplex Eine Lebenserwartung von wenigen Jahren verbunden mit neurologischen Auffälligkeiten bei Patienten mit Niemann-Pick Typ A lässt darauf schließen, dass die ASM- Aktivität einen wichtigen Stellenwert in der normalen Hirnfunktion einnimmt [71]. Neben der NPD spielt die ASM-Aktivität aber auch bei anderen neurologischen Krankheiten, wie Depression, Alzheimer oder auch bei einer Ischämie des Hirngewebes eine Rolle. In einer prospektiven Fall-Kontroll-Studie an Patienten mit depressiver Episode konnte in peripheren Blutzellen eine erhöhte Aktivität der sauren Sphingomyelinase nachgewiesen werden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Antidepressiva wie Imipramin und Amitriptylin zu einer Reduktion dieser Aktivitätssteigerung führen [61]. In frühen klinischen Stadien der Alzheimer Erkrankung konnten erhöhte Level an Ceramid in Patientenhirnen festgestellt werden [44]. Spätere Studien ergänzten die Ergebnisse indem gezeigt wurde, dass ebenfalls ein erhöhtes Aktivitätsniveau der ASM sowie erniedrigte Level an Sphingosine-1-Phosphat (S1P) vorliegen. Das bei der Alzheimer- Erkrankung im Gehirn aggregierte Amyloid-beta-Protein führte hierbei zu einer Aktivierung der ASM im Zellkulturmodell, einem Anstieg von Ceramid im Gewebe und einer gesteigerten Apoptoserate [49]. Ein ischämischer Insult stellt ein schwerwiegendes Krankheitsbild dar. Eine wichtige Rolle spielt hierbei ebenfalls die Signalkaskade rund um die saure Sphingomyelinase. Es zeigte sich bei einer transienten zerebralen Ischämie eine steigende Aktivität der

23 23 ASM, erhöhte Level an Ceramid sowie die Ausschüttung inflammatorischer Zytokine in Wild-Typ-Mäusen, nicht jedoch in ASMKO-Mäusen. ASMKO-Mäuse als auch Wild- Typ-Mäuse unter pharmakologischer Hemmung der ASM wiesen darüber hinaus einen geringeren Gewebeschaden sowie ein geringeres Verhaltensdefizit in der Nachbeobachtung des Insults auf [121]. Zusammengenommen zeigt die Aktivität der ASM nicht nur bei der NPD sondern auch bei anderen neurologischen Krankheitsbildern ihren Einfluss. Daher verspricht die pharmakologische Regulierung der ASM neue Ansätze für Therapiestrategien. 6 Ziele der Arbeit Die ASM und ihre Reaktionsprodukte nehmen entscheidenden Einfluss auf zelluläre Lipidmembranen und die Pathophysiologie unterschiedlichster Krankheitsbilder. Hierbei finden sich, mit Ausnahme der NPD und den Tumorerkrankungen, überwiegend erhöhte Aktivitätsgrade der ASM, wobei die expliziten Regulationsmechanismen, welche zu diesen führen noch unbekannt sind. FIASMAs beziehungsweise kationisch amphiphile Substanzen wie Antidepressiva, die in der Lage sind die ASM funktionell zu inhibieren, bieten eine enorme Chance für neue therapeutische Strategien. Dies beruht auf der Tatsache, dass diese Art der pharmakologischen Intervention unabhängig vom zu Grunde liegenden Aktivierungsmechanismus über die Degradation der ASM deren Aktivität reduziert. Es wurde bereits für unterschiedlichste Antidepressiva in experimentellen Systemen eine Hemmung der ASM gezeigt, nur lagen die dazu verwendeten Konzentrationen des jeweiligen Antidepressivums meist weit über den bei Therapie physiologisch auftretenden Plasmakonzentrationen. In dieser Arbeit wurde die tatsächliche Hemmwirkung von Antidepressiva unterschiedlichster Klassen in deren therapeutischen und damit physiologischen auftretenden Konzentrationen untersucht.

24 24 7 Material und Methoden 7.1 Material Eukaryote Zellen Zelllinie: H4 Herkunft: Glioblastom (human) Referenz: PMid: Puffer und Lösungen Medium: Dulbecco s Mem 500 ml Glutamin 4 mm Penicillin/Streptomycin 1% FCS 10% PBS: NaCl 80 g KCl 2 g Na 2 HPO 4 11,5 g KH 2 PO 4 2 g ph mit HCl auf 7,4 eingestellt H 2 0 bidest ad 1000 ml Enzympuffer: Natriumacetat ph mm EDTA 1,3 mm NP40 0,1% Lysepuffer: Natriumacetat ph mm EDTA 1,3 mm NP40 0,1% Complete EDTA-Tabletten (1 Tablette/10 ml)

25 Verwendete Wirkstoffe Alle verwendeten Wirkstoffen stammen aus der Substanzklasse der Antidepressiva. Antidepressiva zeichnen sich durch die von ihnen vermittelte Verbesserung depressiver Symptome aus. Abhängig von der Substanz wirken Antidepressiva depressionslösend und stimmungsaufhellend sowie psychomotorisch aktivierend oder dämpfend. Der genaue Wirkmechanismus ist noch nicht endgültig geklärt. Klar ist dagegen, dass Antidepressiva den Neurotransmitter-Stoffwechsel beeinflussen und ebenfalls auf Rezeptorebene Einfluss nehmen [77] Trizyklische Antidepressiva Namensgebend für diese Gruppe von Antidepressiva ist ein trizyklischer Anteil in der chemischen Struktur. Die Wirkungsweise beruht auf einer nichtselektiven Serotoninund Noradrenalin-Wiederaufnahmehemmung sowie einen Neurotransmitter-Rezeptor blockierendem Effekt. Eine zusätzliche Beeinflussung von α 1 -Adrenorezeptoren und eine Blockade muscarinerger Rezeptoren begründet eine Vielzahl der Nebenwirkungen [77] Amitriptylin Unter den trizyklischen Antidepressiva stellt Amitriptylin [pubchem CID 2160] die Standartsubstanz dar. Seine Wirkung entfaltet es über eine Wiederaufnahmehemmung von Noradrenalin und Serotonin im synaptischen Spalt monoaminergen Neuronen, was zu einer potenzierten Wirkung der Neurotransmitter führt. Amitriptylin interagiert desweiteren mit muscarinergen und α 1 -adrenergen Rezeptoren, worin sich die sedativen und anticholinergen Eigenschaften begründen [85]. MW: 277,5 g/mol [6] Empfohlener therapeutischer Plasma-Konzentrations-Bereich (ETPKB): 0,288-0,721 µm [6] pk a : 9,40 [64] log P: 5,04 [64] Halbwertszeit (HWZ): 16 h [117] Lösungsmittel: H 2 O

26 Desipramin Eine trizyklische chemische Struktur in Form eines Dibenzazepin stellt Desipramin [pubchem CID 2995] dar. Seine Wirkung besteht in einer selektiven Wiederaufnahmehemmung von Noradrenalin am synaptischen Spalt und einem anzunehmenden Eingreifen in den Serotonintransport. Eine als Nebeneffekt einzustufende anticholinerge Wirkung wird durch eine Affinität zum muscarinergen Rezeptor vermittelt. MW: 266,5 g/mol [6] ETPKB: 0,375-1,126 µm [6] pk a : 10,20 [64] logp: 4,90 [64] HWZ: 21 h [45] Lösungsmittel: H 2 O Clomipramin Verwand mit dem ebenfalls trizyklischem Antidepressivum Imipramin [pubchem CID 2801] führt Clomipramin zu einer selektiven Serotonin-Wiederaufnahme-Hemmung im Gehirn. Dies bewirkt eine erhöhte Konzentration von Serotonin im synaptischen Spalt was wiederrum eine vermehrte Aktivierung der Serotoninrezeptoren bedingt. Das klinische Einsatzgebiet erstreckt sich neben depressiven Syndromen in Panik- und Zwangsstörungen, die Schmerztherapie, sowie die Adipositas- und Bulimiebehandlung. Es ist gut gastrointestinal resorbierbar und wird in der Leber mittels Demethylierung in seinen aktiven Metaboliten Desmethylclomipramine überführt [85]. Bezüglich seiner Wirkungsweise wäre eine Zuordnung von Clomipramin in die Gruppe der SNRIs ebenfalls denkbar [111]. MW: 315,0 g/mol [6] ETPKB: 0,556-1,429 µm [6] pk a : 9,38 [64] logp: 5,19 [64] HWZ: 24 h [4] Lösungsmittel: H 2 O Tetrazyklische Antidepressiva Eine tetrazyklische chemische Struktur und ihre antidepressive Wirkung definieren diese Gruppe [77].

27 Mianserin Die Wirkungsweise von Mianserin [pubchem CID 4184] besteht vor allem in einer antagonistischen Blocke von α-adrenergen Rezeptoren. Darüber hinaus ist ein Antagonismus bei Histamin (H1)- und einigen Typen von Serotoninrezeptoren anzutreffen. Hämatologische Nebenwirkungen, wie Agranulozytosen oder aplastische Anämien, sowie Benommenheits- beziehungsweise Schläfrigkeitszustände wurden bei der Therapie mit Mianserin vereinzelt beobachtet [85]. MW: 264,4 g/mol [6] ETPKB: 0,057-0,265 µm [6] pk a : 8,26 [64] logp: 3,67 [64] HWZ: h [100] Lösungsmittel: Ethanol Maprotilin Ein sowohl funktionell als auch mechanistisch den Trizyklischen ähnliches, jedoch den Tetrazyklischen zugehöriges Antidepressivum stellt Maprotilin [pubchem CID 4011] dar. Als Besonderheit findet sich in der chemischen Struktur ein Brückenringsystem. MW: 277,5 g/mol [6] ETPKB: 0,45-0,721 µm [6] pk a : 10,50 [64] logp: 4,50 [64] HWZ: 43 h [118] Lösungsmittel: H 2 O Selektive-Serotonin-Wiederaufnahme-Inhibitoren (SSRI) Wie der Name bereits ableiten lässt besteht die Wirkung der Gruppe der SSRI in einer spezifischen Wiederaufnahmehemmung von Serotonin im Gehirn [77]. In der Therapie depressiver Syndrome gelten Sie als Mittel der ersten Wahl, da sie sich aus Gründen der leichteren Therapieeinstellung, den geringeren störenden Nebeneffekten, einer größeren Sicherheit bei Überdosierungen und nicht zuletzt aufgrund ihrer effektiveren Wirkung gegen die Trizyklischen durchgesetzt haben. Neben depressiven Syndromen finden sie Anwendung bei Angststörungen, dem Prämenstruellen Syndrom oder der Bulimie [111].

28 Sertralin Sertralin [pubchem CID 68617] führt nicht nur zu einer Blockade der Serotonin- Wiederaufnahme sondern blockiert ebenfalls die Wiederaufnahme von Dopamin [30]. Als unerwünschte Nebenwirkungen treten neben kardiovaskulären und extrapyramidalen [67] Effekten auch sexuelle Funktionsstörungen auf [89]. MW: 306,2 g/mol [6] ETPKB: 0,033-0,163 µm [6] pk a : 9,16 [64] logp: 4,30 [64] HWZ: 25 h [21] Lösungsmittel: DMSO Paroxetin Aufgrund seiner hohen Affinität zum muscarinergen Acetylcholinrezeptor, der Höchsten in der Klasse der SSRI [80], besitzt Paroxetin [pubchem CID 43815] die Eigenschaft durch seine moderate anticholinerge Sedation, Krankheitsbilder wie Schlaflosigkeit oder Angststörungen positiv zu beeinflussen [78]. Darüberhinaus besitzt Paroxetin im Verhältnis zu den anderen SSRIs eine stärkere hemmende Wirkung auf die Noradrenalin-Wiederaufnahme [18, 28]. MW: 329,4 g/mol [6] ETPKB: 0,213-0,364 µm [6] pk a : 9,51 [64] logp: 3,89 [64] HWZ: 24 h [20] Lösungsmittel: DMSO Fluoxetin Verglichen mit den anderen Antidepressiva aus der Gruppe der selektiven Serotonin Wiederaufnahme ist Fluoxetin [pubchem CID 3386] ein potenterer Inhibitor des 5- HT 2c -Rezeptors [81]. Diese Hemmung moduliert das Noradrenalin- und Dopaminsystem im Gehirn und führt hierüber zu einer Aktivierung sowie einem Gewichtsverlust [11]. Dieser Effekt ist bei antriebsarmen Patienten durchaus erwünscht, verfehlt jedoch bei ängstlichen Patienten mit Schlaflosigkeit oder Agitiertheit die gewünschte Wirkung.

29 29 MW: 309,3 g/mol [6] ETPKB: 0,388-0,970 µm [6] pk a : 9,50 [64] logp: 4,05 [64] HWZ: h [82] Lösungsmittel: H 2 O Citalopram Citalopram [pubchem CID 2771] ist einer der selektivsten SSRIs und besitzt so gut wie keine aktivierenden beziehungsweise sedierenden Eigenschaften. Annähernd keine Wechselwirkung besteht mit dem Noradrenalin-Rezeptor, dagegen besitzt Citalopram die höchste Affinität zum Histamin-H 1 -Rezeptor in der Gruppe der selektiven Serotonin Wiederaufnahme Hemmern [80]. Unerwünschte Nebenwirkung bestehen in einer möglichen Gewichtszunahme, Konzentrationsschwäche sowie in einer sexueller Dysfunktion [9, 46]. MW: 324,4 g/mol [6] ETPKB: 0,092-0,401 µm [6] pk a : 9,50 [64] logp: 2,51 [64] HWZ: 33 h [75] Lösungsmittel: H 2 O Alaproclate Einen der älteren spezifischen Serotonin-Wiederaufnahmehemmer repräsentiert Alaproclate [pubchem CID 2081]. Andere Rezeptoren wie 5-HT, Histamin-H 1, α 1 -, α 2 - adrenerg sowie Dopamin D2-Rezeptoren werden nicht beeinflusst. Auffällig ist eine in vivo regional selektive Wiederaufnahmehemmung von Serotonin, besonders ausgeprägt im Hippocampus und Hypothalamus [79]. MW: [g/mol] [pubchem CID 2081] ETPKB: 0,4-2 µm [106] pk a : 7,76 [64] logp: 2,93 [64] HWZ: 5 h [106] Lösungsmittel: H 2 O

30 Selektive-Noradrenalin-Wiederaufnahme-Inhibitoren (NRI) - Reboxetin Seine hohe Affinität zum Noradrenalin-Rezeptor machen Reboxetin [pubchem CID 65856] zu einem, im Vergleich zu trizyklischen Antidepressiva, sehr nebenwirkungsarmen Medikament. Im Gegensatz zu den SSRI kommen unerwünschte Arzneimittelwirkungen wie sexuelle Dysfunktion oder gastrointestinale Störungen bei Reboxetin seltener vor [42]. MW: 313,4 g/mol [6] ETPKB: 0,032-0,319 µm [6] pk a : 8,37 [64] logp: 2,82 [64] HWZ: 12 h [25] Lösungsmittel: H 2 O Noradrenalin- und selektiver Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (NaSSA) Mirtazapin Von der Struktur einem tetrazyklischen Antidepressivum ähnlich gehört Mirtazapin [pubchem CID 4205] in die Gruppe der NaSSA und agiert als ein Antagonist am α 2 - adrenergen Rezeptor sowie an postsynaptischen 5-HT 2 und 5-HT 3 Rezeptoren. Desweiteren besitzt Mirtazapin antagonistische Eigenschaften am Muskarin-Rezeptor sowie insbesondere am Histamin-H 1 Rezeptor. In der Therapie der Depression aber auch für andere psychiatrische Indikationen steht mit Mirtazapin ein effektives Medikament zur Verfügung. Stark sedierende Eigenschaften, Mundtrockenheit, Schwindel sowie gesteigerter Appetit verbunden mit Gewichtszunahme stellen unerwünschte Nebenwirkungen dar [15]. MW: 265,4 g/mol [6] ETPKB: 0,151-0,301 µm [6] pk a : 7,30 [64] logp: 2,75 [64] HWZ: h [113] Lösungsmittel: DMSO

31 Methoden Zellkultur Kultiviert wurden H4-Zellen, die einer Glioblastom-Zelllinie angehören. Die Kultur der H4-Zellen erfolgte in Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM) bei 37 C und 5% CO 2. Zugesetzt wurde dem Grundmedium 4 mm Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin sowie 10% FCS. Für die Routinezellkultur erfolgte eine regelmäßige Splittung der Zellen in T75-Zellkulturflaschen. Dazu wurde das überschüssige Medium entfernt, die Zellen mit PBS gewaschen und anschließend 5 Minuten mit Trypsin inkubiert bevor das Resubstituieren der Zellen mit vorgewärmten Medium erfolgte. Um im Anschluss 1x10 6 Zellen pro T75 neu auszubringen zu können, wurde eine Zählung der Zellen mittels des Casy-Systems durchgeführt Bestimmung der Zellzahl Mit Hilfe des Casy-Systems (Innovatis/Schärfe Systhems) erfolgten die Zählung der Zellen sowie die Überprüfung auf deren Viabilität und Aggregation, um die Qualität der Zellen stetig zu überwachen. Das Casy-System beruht auf ISO 13319, was der internationalen standardisierten Referenzmethode für Partikelzählungen entspricht. Darüber hinaus ermöglich die zusätzlich integrierte Puls-Flächen-Analyse einen maximierten Informationsgewinn bezüglich der Zellbeschaffenheit Mykoplasmentestung Mykoplasmen wurden lange Zeit in der fortlaufenden Zellkultur als gewöhnliche Kontamination erachtet. Mittlerweile ist allerdings bekannt, dass ihre Präsenz zu einem Konkurrieren der kultivierten Zelle und der Mykoplasmen um die im Medium vorhandenen Nährstoffe führt. Ausdruck eines mangelten Nährstoffangebotes ist eine reduziertee Zellproliferationsrate sowie Veränderungen in der Zellantwort. Aus diesem Grund erfolgte eine regelmäßige Testung der H4-Zellen auf Mykoplasmen-Kontamination mittels MycoAlert Mycoplasma Detection Kit (Lonza, Köln), welche sich stets als negativ erwies Hemmung der ASM Für die Hemmung der ASM wurden die H4-Zellen mit 1,5 x 10 5 Zellen pro Well ausgebracht und für 24 Stunden kultiviert. Anschließend erfolgte die Stimulation mit Antidepressiva in einer Konzentrationsreihe. Als Kontrolle diente das entsprechende subs-