Gene expression in Streptococcus mutans biofilms

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1 Zurich Open Repository and Archive University of Zurich Main Library Strickhofstrasse 39 CH-8057 Zurich Year: 2010 Gene expression in Streptococcus mutans biofilms Banu, Liliana Danusia Abstract: Summary Streptococcus mutans is considered the major aetiological agent of human dental caries. It is an obligate biofilm-forming bacterium, which resides on teeth and forms, together with other species, an oral biofilm that is often designated as supragingival plaque. This thesis consists of three distinct parts. The first part describes, using microarray analysis, how S. mutans modulates gene expression when grown under different conditions in biofilms. The goal of this analysis was to identify genes that are required for establishment and survival in biofilms. When grown in exponential biofilms S. mutans increased the expression of uptake systems for Mn2+, suggesting a requirement for this element for proper establishment in biofilm. Furthermore, S. mutans down-regulated genes associated with sucrose-dependent adhesion (spap, gtfb). When exponential biofilms were cultivated in the presence of sucrose, a specific sucrose-transporter was activated. Compared with planktonic growth, stationary phase biofilms showed a greater change in their gene expression profile than biofilms harvested from the exponential growth phase, indicating that different regulation modes of growth processes are operating under altered environmental conditions. Again compared with planktonic growth, stationary phase biofilms grown with glucose showed up-regulation of genes involved in carbohydrate metabolism and signal transduction, and down- regulation of genes associated with translation, energy production and amino-acid transport, and metabolism. A gene cluster comprising the lrga and lrgb genes, which are predicted to be involved in cell death, was also highly up-regulated in these biofilms. Comparison of the transcriptome of a sucrose-grown stationary biofilm with that of a glucose- grown stationary biofilm culture suggested that there may be more DNA damage in the former, since several genes coding for repair enzymes were up-regulated. Energy consumption and the metabolism of amino-acids and sugars were decreased. When comparing starved biofilms with fed biofilms of S. mutans, the latter showed an increase in expression of genes required for transcription and translation, as well as of genes incoding a specific PTS system responsible for the uptake of sucrose. The opposite pattern was observed when biofilms were transfered from replete medium to starving conditions. In the second part of this work, the involvement of the two gene clusters lrgab and cidab in cell death was investigated. Using real-time RT-PCR, it was found that expression of lrgab increased with rising cell density. A similar pattern was observed for lytsr, which encodes a two-component signal transduction system. Further analysis suggested that the lrgab genes were negatively regulated by LytSR. The lrgab genes appear to be important for long-term survival, since a lrgab knock-out mutant exhibited a 3log10-decrease in viable cell count after 13 days of incubation. The expression of lrgab increased in response to lactic acid, the predominant organic acid found in culture media from bacteria grown with sucrose as the sole carbon source. The exposure of S. mutans to CCCP, an ionophore that affects both components of the proton motive force, resulted in high expression of lrgab. Biofilm formation was not affected in both lrgab and cidab mutants. Overall, it was shown that the lrgab gene cluster encodes an important factor for S. mutans survival in stationary phase. This factor is probably required to withstand low ph, starvation, or membrane-damaging agents. Bacteria can detect, transmit and react to signals from the outside world by two-component systems and by serine-threonine kinases and phosphatases first detected eukaryotic cells, but later recognized to occur widespread in bacteria as well. S. mutans contains one such serine-threonine kinase, encoded by pknb. A gene encoding serine-threonine phosphatase, pppl, is located upstream of pknb. In the third part of the work, the phenotypes of single mutants in pknb and pppl and of a pknb - pppl double mutant were characterized. All mutants showed abnormal cell shapes

2 and grew slower than the wild type. Whole genome transcriptome analysis revealed that a pknb mutant showed reduced expression of genes in bacteriocin production and genetic competence. Among the genes that were differentially regulated in the pknb mutant several were likely involved in cell-wall metabolism. One such gene, SMU.2146c, and two genes encoding bacteriocins were shown to be also down-regulated in a mutant in vick, a sensor kinase involved in response to oxidative stress. Collectively, the results indicate that PknB can modulate the activity of the two-component signal transduction systems VicKR and ComDE. Streptococcus mutans gilt als wichtigster Verursacher der humanen Karies. S. mutans ist ein obligat Biofilm bildendes Bakterium, das auf der Oberfläche von Zähnen wächst und zusammen mit anderen Bakterien einen oralen Biofilm bildet, der allgemein als supragingivale oder auch koronale Plaque bezeichnet wird. Diese Dissertation besteht aus drei Teilen. Der erste Teil beschreibt wie S. mutans Bakterien ihre Genexpression ändern, wenn sie unter verschiedenen Bedingungen im Biofilm wachsen. Das Ziel dieser mit Microarrays ausgeführten Analyse war es, Gene, welche für die Etablierung und das Überleben im Biofilm notwendig sind, zu identifizieren. Im Vergleich zu planktonischen Kulturen erhöhte S. mutans in exponentiell wachsenden Biofilmen die Expression von Genen, die für die Mn 2+- Aufnahme kodieren. Dies weist auf einem erhöhten Bedarf an Mn2+ Ionen bei der Biofilm Bildung hin. Weiter wurden mit der Saccharose-abhängigen Adhäsion assoziierte Gene in ihrer Expression herabreguliert (spap, gtfb). Umgekehrt erwies sich in in Anwesenheit von Saccharose gezüchteten und aus der exponentiellen Wachstumsphase geernteten Biofilmen, das für einen spezifischen Saccharose- Transporter kodierende Gen als aufreguliert. Im Vergleich mit planktonisch wachsenden Zellen wiesen Biofilme in der stationären Phase eine grössere Änderung im Transkriptom auf als Biofilme in der exponentiellen Wachstumsphase, was auf unterschiedliche Formen der Regulation der Wachstumsprozesse hinweist. Gene deren Produkte am Zuckermetabolismus und in der Signaltransduktion beteiligt sind waren in Biofilmen aus der stationären überexprimiert und Gene welche mit Translation, Energieproduktion und Aminosäuretransport und Aminosäuremetabolismus assoziiert sind, erwiesen sich als herunterreguliert. Der lrgab Genkomplex, dessen Produkt wahrscheinlich am Zelltod beteiligt ist, war in Biofilmen stark aufreguliert. Wenn Saccharose statt Glukose als Kohlehydratquelle im Medium angeboten wurde, führte dies in stationären Biofilmen zur Aufregulierung von Genen welche für DNA Reparaturenzyme kodieren. Dies deutet darauf hin, dass es in Saccharose-gewachsenen Biofilmen vermehrt zu DNA-Schädigungen kommt. Die Transkription von Genen, welche am Energieverbrauch sowie am Metabolismus von Aminosäuren und Zuckern beteiligt sind, wurde in mit Saccharose gezüchteten, stationären Biofilmen herunterreguliert. Der Wechsel von Biofilmen aus Speichel in ein nährstoffreiches Medium führte zu einer Zunahme der Expression von Genen mit Bedeutung in der Kontrolle von Transkription und Translation. Ebenso wurde das Gen kodierend für ein Saccharose-PTS-System markant aufgeguliert. Das Gegenteil wurde nach der Verlagerung von Biofilmen von einem nährstoffreichen Medium in Speichel beobachtet. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Beteiligung der beiden Genkomplexe lrgab und cidab am Zelltod untersucht. Mittels Real-Time RT-PCR konnte beobachtet werden, dass die Expression von lrgab durch das Zwei- Komponenten-Signaltransduktion-System LytSR negativ reguliert wurde. Die Expression von lrgab und lytsr nahm mit zunehmender Zelldichte zu. Die lrgab Gene sind vermutlich für das langfristige Überleben von S. mutans Zellen wichtig, da eine lrgab Knock-out- Mutante im Vergleich zum Wildtyp Stamm nach 13 Inkubation Tagen eine Abnahme der Anzahl an lebensfähigen Zellen um 3 log-stufen aufwies. Die Anwesenheit im Medium von Milchsäure die prädominant produzierte organische Säure wenn S. mutans mit Saccharose als Kohlenstoffquelle wächst führte zu einem Anstieg der lrgab Expression. Ebenfalls zu höherer Expression von lrgab führte die Exposition von S. mutans gegenüber CCCP, einem Ionophor das beide Komponenten des Systems inhibiert, welches den Zellwand Protonengradienten steuert. Ein Unterschied in der Biofilm- Bildung konnte aber weder für lrgab noch für cidab Mutanten nachgewiesen werden. Insgesamt zeigen die Befunde, dass die Gene des lrgab Komplexes für einen Faktor kodieren, welcher für das Überleben von S. mutans in der stationären Phase wichtig ist. Dieser Faktor ist wahrscheinlich notwendig um bei niedrigen ph-werten, bei Mangel an Nährstoffen oder bei Vorliegen von Membranschäden überleben zu können. Bakterien können Signale aus der Außenwelt mit Zweikomponenten- Signaltransduktionssystemen und mit Hilfe von Serin/Threonin Kinasen, sowie den dazugehörenden Phosphatasen, übertragen. S. mutans enthält eine Serin/Threonin Kinase, die durch pknb kodiert wird. Das pppl Gen, welches eine Serin/Threonin Phosphatase kodiert, befindet sich stromaufwärts von pknb. Im dritten Teil der Arbeit wurden die Phänotypen von Mutanten der pknb und pppl Gene untersucht. Die Mutanten zeigten abnormale Zellformen und wuchsen im Vergleich zum Wild-Typ Stamm langsamer. Die Transkriptom Analyse zeigte, dass in der pknb Mutante die Expression von Genen herabreguliert war, welche für Bakteriozine kodieren. Ebenso betroffen waren Gene mit Bedeutung in der Steuerung genetischer Kompetenz und des Zellwandmetabolismus. Ein solches Metabolismusgen (SMU.2146c) und zwei Bakteriozingene erwiesen sich auch in einer vick Mutante, welche für eine Sensor-Kinase kodiert, als herabreguliert. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass PknB die Aktivität der Zweikomponenten Signaltransduktionssysteme VicKR und ComDE modulieren kann. 2

3 Posted at the Zurich Open Repository and Archive, University of Zurich ZORA URL: Dissertation Originally published at: Banu, Liliana Danusia. Gene expression in Streptococcus mutans biofilms. 2010, University of Zurich, Faculty of Science. 3

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