Cortisol Saliva Luminescence Immunoassay

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1 Arbeitsanleitung Cortisol Saliva Luminescence Immunoassay Lumineszenz Immunoassay zur quantitativen in-vitro-diagnostischen Bestimmung von Cortisol in humanem Saliva. RE62111/RE / 960 Rx only 2-8 C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 1. ZWECKBESTIMMUNG Der IBL International Cortisol Saliva Lumineszenz Immunoassay dient zur quantitativen in-vitrodiagnostischen Bestimmung von Cortisol in humanem Saliva und für die Beurteilung bei der Diagnose und Therapie von Nebennieren-Erkrankungen. Dieser Assay ist nicht zur Point-of-Care-Diagnostik bestimmt. 2. KLINISCHE BEDEUTUNG Cortisol (Hydrocortisone, Bestandteil F) ist das wichtigste Glukocorticoid im Menschen und wird in der Zona fasciculata der Nebennierenrinde produziert. 90 % des im Blut zirkulierenden Cortisols sind an Corticoidbindendes Globulin (CBG, Transcortin), ca. 7 % an Albumin gebunden und nur 1 3 % liegen ungebunden vor. Nur das letztere stellt die aktive Form des Cortisols da. Freies Cortisol wird in den Speichel abgegeben und wird gemeinsam mit Cortisolmetaboliten über die Nieren ausgeschieden. Die Konzentration des freien Cortisols im Blut reguliert auch dessen Sekretion aus der Nebennierenrinde in einem negativen Feedback-Mechanismus über CRH (Corticotropin releasing hormone) aus dem Hypothalamus und ACTH aus der Hypophyse. Es wird aber auch durch die jeweilige individuelle Situation beeinflusst, vor allem durch Stress. Beim Menschen gibt es physiologische Schwankungen mit der höchsten Konzentration morgens und der niedrigsten um Mitternacht. Diese Fluktuation des Cortisol-Spiegels liegt auch im Speichel vor mit einem Peak in den ersten 90 Minuten nach dem Aufwachen. Die Cortisol Messung ist bei Nebennierenstörungen indiziert. Aufgrund der tageszeitlichen Schwankungen ist eine Speichelprobengewinnung ideal, da sie im Gegensatz zu wiederholten Blutabnahmen einfach und ohne weitere Belastung möglich ist. 3. TESTPRINZIP Kompetitiver Lumineszenzimmunoassay. Die unbekannte Menge an Antigen in der Probe und eine bekannte Menge an enzymmarkiertem Antigen (E-Ag) konkurrieren um die Bindungsstellen des an die Wells der Mikrotiterstreifen gebundenen Antikörpers. Nach der Inkubation wird nicht gebundenes E-Ag durch Waschen entfernt. Die Intensität der ausgelösten Lumineszenz nach Zugabe der Lumineszenz- Substratlösung ist umgekehrt proportional zur Antigen-Konzentration in den Proben. Die Ergebnisse der Proben können direkt anhand der Standardkurve bestimmt werden. 4. WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN 1. Nur zum In-vitro-Gebrauch. Nur für den Gebrauch durch gut ausgebildetes Personal. 2. Vor der Testdurchführung sollte die Arbeitsanleitung vollständig und sorgfältig gelesen werden und verstanden worden sein. Die gültige Version aus dem Kit verwenden. 3. Im Falle einer erheblichen Beschädigung der Testpackung ist IBL bzw. der jeweilige Lieferant innerhalb einer Woche nach Empfang der Ware schriftlich zu benachrichtigen. Beschädigte Komponenten dürfen nicht zur Testdurchführung verwendet werden, sondern sollten solange aufbewahrt werden, bis der Transportschaden endgültig geregelt ist. 4. Zerbrochenes Glas kann zu Verletzungen führen. Vorsicht bei Glasgefäßen. 5. Chargen-Nummer und Verfallsdatum beachten. Es dürfen keine Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen in einem Test verwendet werden. Verfallene Reagenzien dürfen nicht verwendet werden. 6. Gute Laborpraxis und Sicherheitsrichtlinien beachten. Je nach Bedarf sollten Laborkittel, Einmal- Latexhandschuhe und Schutzbrillen getragen werden. 7. Reagenzien dieses Kits, die Gefahrstoffe enthalten, können Reizungen der Augen und der Haut hervorrufen. Siehe Angaben in KOMPONENTEN DES KITS und auf den Etiketten. Sicherheitsdatenblätter für dieses Produkt sind auf der IBL-Homepage zum Download verfügbar oder auf Anfrage direkt von IBL erhältlich. 8. Chemikalien und vorbereitete oder gebrauchte Reagenzien sind unter Beachtung der jeweiligen nationalen Bestimmungen als Gefahrstoffabfall zu entsorgen. 9. Das Reinigungspersonal ist durch das Fachpersonal bezüglich möglicher Gefahren und Umgang anzuleiten. 5. LAGERUNG UND HALTBARKEIT Der Kit wird bei Umgebungstemperatur angeliefert und sollte bei 2-8 C gelagert werden. Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. Hinweise zur Lagerung und Haltbarkeit der Proben und vorbereiteten Reagenzien sind den entsprechenden Kapiteln zu entnehmen. Die Mikrotiterplatte ist auch nach dem Öffnen der Verpackung bis zum Verfallsdatum des Kits haltbar, wenn der Beutel sorgfältig wieder verschlossen und bei 2-8 C gelagert wird. Version / 7

3 6. PROBENGEWINNUNG UND -AUFBEWAHRUNG Saliva Der Patient sollte 30 min vor der Probennahme nicht essen, trinken, Kaugummi kauen oder Zähne putzen. Andernfalls 5 min vor der Probenahme den Mund gründlich mit kaltem Wasser spülen. Salivaproben sollten nicht bei Krankheiten, Entzündungen oder Verletzungen der Mundhöhle genommen werden (Blutkontamination). Speichel kann unter Verwendung der Sarstedt Cortisol Salivette, welche zum Sammeln von Speichel für den Zweck der Bestimmung von Cortisol zugelassen ist, gesammelt werden. Es sollten mindestens 0.5 ml Flüssigkeit gesammelt werden. Der Speichelfluss kann durch Kauen auf Parafilm stimuliert werden. Es wird empfohlen, die Salivaproben vor der Testdurchführung bei 20 C einzufrieren und nach dem Auftauen zu mischen und 10 min bei x g zu zentrifugieren (um Partikel zu entfernen). Die Salivaproben müssen visuell einwandfrei sein. (Rötliche Färbung deutet auf Kontamination mit Blut hin.) Lagerung: 37 C C 2-8 C -15 C (aliquotiert) Haltbarkeit: 1 Woche 2 Wochen 2 Wochen 6 Monate 7. KOMPONENTEN DES KITS RE62111 RE62119 Symbol Komponente 1 x 12 x 8 10 x 12 x 8 MTP 1 x 13 ml 1 x 120 ml ENZCONJ 1 x 3.5 ml 1 x 20 ml 1 x 6 x 1.0 ml 1 x 6 x 3.5 ml CAL A-G 2 x 1.0 ml 2 x 3.5 ml CONTROL x 4.5 ml 2 x 45 ml LUMINREAG x 100 ml 5 x 100 ml WASHBUF CONC 3 x 12 x FOIL Haftklebefolie Mikrotiterplatte Weiß gefärbt. Beschichtet mit anti-cortisol Antikörpern (Kaninchen). Enzymkonjugat Gelb gefärbt. Gebrauchsfertig. Enthält: Cortisol (chromatographisch gereinigt, nicht humanen Ursprungs), konjugiert mit HRP, Stabilisatoren. Standard A-G 0; 0.015; 0.03; 0.10; 0.40; 1.00; 3.20 µg/dl 0; 0.15; 0.3; 1.0; 4.0; 10; 32 ng/ml 0; 0.41; 0.83; 2.8; 11; 28; 88 nmol/l Gebrauchsfertig. Enthält: Cortisol (nicht humanen Ursprungs), Puffer, 0.1 % BSA, 0.1 % ProClin. Kalibriert gegen NIST Standard Referenz Material #921. Kontrolle 1+2 Gebrauchsfertig. Enthält: Cortisol, (nicht humanen Ursprungs), niedrig und hoch, Puffer, 0.1 % BSA, 0.1 % ProClin. Konzentrationen / Akzeptanzbereiche siehe QC-Zertifikat. Chemilumineszenzreagenz 1+2 Gebrauchsfertig. Reagenz 1: Enthält: Luminol-Verstärker. Reagenz 2: Enthält: Peroxidlösung, Stabilisatoren. Waschpuffer Konzentrat (10x) Enthält: Phosphatpuffer, Tween, Stabilisatoren. 8. ZUSÄTZLICHES MATERIAL (NICHT IM KIT ENTHALTEN) 1. Pipetten (Multipette Eppendorf oder vergleichbare Produkte, < 3 % VK). Volumina: 20; 50; 100; 1000 µl 2. Cortisol Salivette von SARSTEDT INC. 1025, St. James Church Road P.O. Box 468 Newton NC , Catalogue # Zentrifuge 4. Vortex-Mischer 5. 8-Kanal Mikropipette mit Reagenziengefäßen 6. Waschflasche, automatisches oder halbautomatisches Waschsystem für Mikrotiterplatten 7. Lumineszenz Immunoassay-Messgerät 8. Bidest. oder deionisiertes Wasser 9. Papiertücher, Pipettenspitzen, Stoppuhr 9. HINWEISE ZUR TESTDURCHFÜHRUNG 1. Fehler bei der Handhabung der Proben oder Abweichungen von der beschriebenen Testdurchführung können die Ergebnisse verfälschen. Die angegebenen Pipettiervolumina, Inkubationszeiten, Temperaturen und Vorbereitungsschritte sind unbedingt gemäß Arbeitsanleitung einzuhalten. Nur kalibrierte Pipetten und Geräte verwenden. Version / 7

4 2. Sobald mit der Testdurchführung begonnen wird, sollten alle Arbeitsschritte ohne Unterbrechung durchgeführt werden. Es ist sicherzustellen, dass alle benötigten Reagenzien, Geräte und Hilfsmittel zur rechten Zeit zur Verfügung stehen. Alle Reagenzien und Proben müssen auf Raumtemperatur (18-25 C) gebracht und vor Gebrauch vorsichtig ohne Schaumbildung gemischt werden. 3. Kontaminationen der Reagenzien, Pipetten und Wells/Röhrchen sind zu vermeiden. Neue Einmal- Pipettenspitzen für jede zu pipettierende Komponente und jede Probe verwenden. Die Deckel der Fläschchen nicht vertauschen. Nicht benötigte Fläschchen immer verschlossen halten. Wells/Röhrchen oder Reagenzien dürfen nicht wiederverwendet werden. 4. Alle Standards, Kontrollen und Patientenproben sind in Doppelbestimmung durchzuführen. 5. Es sollte ein Pipettierschema verwendet werden um die Identifikation der Standards und Proben auf der Platte sicherzustellen. 6. Die Inkubationszeiten beeinflussen die Ergebnisse. Bei jedem Pipettierschritt sollten alle Wells in der gleichen Reihenfolge und im gleichen Zeittakt behandelt werden. Die Verwendung einer 8-Kanal- Mikropipette zum Pipettieren in alle Wells wird empfohlen. 7. Die korrekte Durchführung der Waschschritte ist entscheidend. Ungenügend gewaschene Wells ergeben falsche Ergebnisse. Die Verwendung einer Multikanalpipette oder eines automatischen Waschsystems für Mikrotiterplatten wird empfohlen. Zwischen den Inkubationen die Wells nicht austrocknen lassen. Beim Waschen und Ausschütteln dürfen die beschichteten Wells nicht beschädigt werden. Alle Reagenzien müssen daher mit Vorsicht pipettiert werden. Beim Waschvorgang ist es wichtig, dass alle Wells vollständig und gleichmäßig mit Waschpuffer gefüllt werden und nach dem Ausschütteln kein Rückstand an Flüssigkeit zurückbleibt. 8. Feuchtigkeit beeinflusst die beschichteten Wells/Röhrchen. Verpackung nicht öffnen bevor Raumtemperatur erreicht ist. Nicht benötigte Wells/Röhrchen sofort in den wieder verschließbaren Beutel mit Trockenmittel zurückgeben. 10. TESTVORBEREITUNGEN 1.1. Vorbereitung konzentrierter Komponenten Verd. / rekonst. Komponente Diluent Verhältnis Bemerkungen Lagerung Haltbarkeit 10 ml WASHBUF ad 100 ml bidest. Wasser 1:10 Gründlich mischen. 2-8 C 4 Wochen Herstellung der Substratlösung-Mischung Verd. / Komponente mit Komponente Verhältnis Bemerkungen Lagerung Haltbarkeit rekonst. 1 ml LUMINREAG 1 1 ml LUMINREAG Gründlich mischen C 8 Std Probenverdünnung Proben, bei denen eine Konzentration über 3.0 µg/dl erwartet wird, müssen mit Standard A verdünnt werden. Die Werte von verdünnten Proben müssen mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor multipliziert werden. 11. TESTDURCHFÜHRUNG 1. Alle Standards, Kontrollen und Patientenproben sind in Doppelbestimmung durchzuführen. Je 20 μl der Standards, Kontrollen und Proben in die entsprechenden Wells der Mikrotiterplatte pipettieren 2. Je 100 µl Enzymkonjugat in jedes Well pipettieren. Platte mit Haftklebefolie abdecken. Platte vorsichtig schütteln h bei RT (18-25 C) inkubieren. 4. Folie entfernen. Inkubationslösung verwerfen. Platte 4 x mit je 250 µl verdünntem Waschpuffer waschen. Restliche Flüssigkeit auf Papiertüchern ausklopfen. 5. Je 50 µl der vorbereiteten Substratlösung-Mischung in jedes Well pipettieren, in der gleichen zeitlichen Verzögerung, mit der das Luminometer später misst (Berthold Luminometer: 2 sec pro Well). 6. Nach 10 min die relativen Lumineszenzeinheiten (RLU) mit einem Luminometer messen. Version / 7

5 12. QUALITÄTSKONTROLLE Die Testergebnisse sind nur gültig, wenn der Test gemäß der vorliegenden Arbeitsanleitung abgearbeitet wurde. Ferner muss der Anwender die GLP-Regeln (Good Laboratory Practice) oder vergleichbare Normen/Gesetze beachten. Anwender und/oder Labor müssen zur Diagnosestellung ein gemäß GLP validiertes System verwenden. Alle Kit-Kontrollen müssen innerhalb der Akzeptanzbereiche, die auf den Etiketten und dem QC-Zertifikat angegeben sind, gefunden werden. Wenn die Kriterien nicht erfüllt sind, sind die Ergebnisse ungültig und der Test sollte wiederholt werden. Jedes Labor sollte darüber hinaus eigene bekannte Proben als weitere Kontrollen mitführen. Es wird empfohlen, an den einschlägigen Ringversuchen teilzunehmen. Bei Abweichungen sind die folgenden Fehlermöglichkeiten zu überprüfen: Haltbarkeit der (vorbereiteten) Reagenzien, Lagerungsbedingungen, Pipetten, Geräte und Hilfsmittel, Inkubationsbedingungen und Waschmethoden. 13. TESTAUSWERTUNG Die Mittelwerte der RLU (Relative Luminescence Units) für alle Standards, Kontrollen und Patientenproben berechnen. Die erhaltenen RLU Mittelwerte der Standards (y-achse, linear) gegen deren Konzentration (x-achse, logarithmisch) auftragen, entweder auf semi-logarithmischem Papier oder durch ein entsprechendes Computerprogramm. Bei Verwendung eines Computerprogramms werden die Cubic-Spline-Methode, 4- Parameter-Analyse (lin-log) oder Logit-Log-Berechnung empfohlen. Zur Berechnung der Standardkurve sollten alle Werte der Standards verwendet werden (bei Doppelwerten kann ein offensichtlicher Ausreißerwert eliminiert und stattdessen der plausiblere Einzelwert verwendet werden). Die Konzentrationen der Proben können direkt von der Standardkurve abgelesen werden. Proben, die oberhalb des höchsten Standards gemessen werden, müssen wie in TESTVORBEREITUNGEN beschrieben verdünnt und erneut analysiert werden. Die Werte von verdünnten Proben müssen mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor multipliziert werden. Salivaproben mit erheblich überhöhten Werten könnten mit Blut kontaminiert sein und sollten entsprechend überprüft werden. Umrechnung: Cortisol (ng/ml) x 2.76 = nmol/l Cortisol x 27.6 = nmol/l Messbereich Saliva: µg/dl Cortisol Typische Standardkurve (Beispiel. Nicht zur Testauswertung verwenden!) Standard Cortisol Mittelwert Luminescence (RLU) RLU/RLU max A B C D E F G NORMWERTE Die Referenzbereiche wurden mit prospektiv gesammelten Proben von 325 scheinbar gesunden 76 Männern und 76 Frauen an zwei unabhängigen Zeitpunkten an einer Sammelstelle in den Vereinigten Staaten etabliert. Der Speichel wurde mit der Cortisol Salivette von SARSTEDT Int. gesammelt. Die Einschlusskriterien für die gesunde Erwachsenenbevölkerung waren Erwachsene zwischen Jahren, Geschlecht und Rasse mit normalen TSH und TPO Level, zur Zeit der Probenentnahme nicht in ärztlicher Behandlung oder in einer Drogentherapie und gesund. Version / 7

6 Die Ausschlußkriterien umfassten Patienten in einer Cortisol Therapie, Hormon Therapie oder die orale Kontrazeptiva einnehmen, Patienten mit implantierten Kontrazeptiva, Patienten mit Hintergrund auf Schilddrüsen- oder anderen Autoimmunerkrankungen, mit Hintergrund auf Cushing-Syndrom oder Morbus Addison, schwangere oder stillende Frauen. Die Referenzbereichstudie wurde von zwei Personen in fünf Tagen durchgeführt. Pro Tag erfolgten maximal drei Testläufe, mit hohen und niedrigen Kit-Kontrollen und mit unterschiedlichen humanen Speichelproben. Jede Probe wurde einmal in Doppelbestimmung mit einer Reagenziencharge getestet. Die folgende Tabelle zeigt die Zusammenfassung der Ergebnisse: 2.5% Perzentil 97.5% Perzentil Teilung vormittags (vor 10:00h) nachmittags (zwischen 14:00h und 16:00h) n Referenz 90% Konfidenzintervall Untere Obere Referenz 90% Konfidenzintervall Untere Obere Weitere Literatur (13) empfiehlt die folgenden Bereiche für Cortisol-Konzentrationen während des Tages: Gruppe n Bereich vormittags Bereich nachmittags Männer im Alter von ND Frauen im Alter von ND Männer im Alter von ND Frauen im Alter von ND Männer im Alter von ND Frauen im Alter von Alle Erwachsenen ND Jedes Labor sollte unter Berücksichtigung regionaler Gegebenheiten eigene Normalwertbereiche erstellen. Therapeutische Konsequenzen sollten nicht allein aufgrund der mit diesem Test ermittelten Werte getroffen werden, sondern nur unter Berücksichtigung aller klinischen Beobachtungen und weiterer diagnostischer Mittel. Benutzer und / oder Laboratorien müssen ein validiertes System zur Bestimmung der Diagnose nach GLP aufweisen. Das Testergebnis kann als Hilfe bei der Diagnose und Behandlung von Nebennierenerkrankungen verwendet werden, wenn es nicht nur auf dem Ergebnis des einzelnen Testverfahrens basiert. 15. GRENZEN DES VERFAHRENS Bereiche von Kindern wurden bisher nicht mit diesem Test evaluiert. Erhöhte Cortisolspiegel können während der Schwangerschaft, bei stillenden Frauen und bei Frauen, die Verhütungsmittel nehmen gefunden werden. Hohe Cortisolkonzentrationen können auch im Zustand der Schwangerschaft, bei Sepsis, Infektionen oder chronischer Leber- und Nierenerkrankung auftreten. Niedrige Cortisolspiegel resultieren aus Lebererkrankungen, Hypophyse Hyposekretion, Hypothyreose oder Steroidtherapie. Die Verwendung von Cremes oder Medikamenten, die Prednisolon und 11-Deoxycortisol enthalten, sollten vermieden werden, da diese eine präanalytische Kontamination der Speichelprobe verursachen könnten (exakte Daten siehe Abschnitt Kreuzreaktivität im folgenden Kapitel 16. Testcharakteristika). Die korrekte Durchführung der Probengewinnung und Aufbewahrung ist entscheidend für die Testergebnisse. Näheres siehe PROBENGEWINNUNG UND -AUFBEWAHRUNG. Angaben zu Kreuzreaktivitäten sind im Kapitel TESTCHARAKTERISTIKA zu finden. Hinweis: Speichelproben, die Thimerosal, Natrium Azid bzw. Blutspuren enthalten, sollten nicht mit dem Assay gemessen werden. Version / 7

7 Die folgenden Substanzen wurden auf signifikante Effekte auf die Testergebnisse geprüft: Potentiell störende Untersuchter Konzentrationsbereich der Höchste getestete Konzentration zeigt Substanz potentiell störenden Substanz > 10% Unterschied auf die Cortisol Konzentration Blut mg/ml Blutkonzentration muss < 0.10 mg/ml sein Ethanol mg/ml Kein Einfluss bis zu mg/ml Nahrungsmittel mg/ml Kein Einfluss bis zu 1.11 mg/ml Kaugummi mg/ml Kein Einfluss bis zu 11.1 mg/ml Nikotin 0-10 mg/ml Kein Einfluss bis zu 1.0 mg/ml Koffein µg/ml Kein Einfluss bis zu 1000 µg/ml 16. TESTCHARAKTERISTIKA Analytische Spezifität (Kreuzreaktivität) Die Studie zur Kreuzreaktivität wurde im Zeitraum von acht Tagen, von einer Person durchgeführt. Pro Tag wurden maximal fünf Versuche, mit hohen und niedrigen Kit-Kontrollen und 3 verschiedenen human Speichelproben, gespickt mit potentiell störenden Substanzen in sechs unterschiedlichen Konzentrationen (0, 0,1, 1, 10, 100, 1000 und µg/dl) durchgeführt. Jede Probe wurde einmal in Doppelbestimmung mit einer Reagenziencharge getestet. Analytische Sensitivität (Nachweisgrenze des Blank LoB) Funktionelle Sensitivität (Nachweisgrenze NG LoD, Quantifizierungsgrenze QG LoQ) Wiederfindung (Probenverdünnung) Linearität Wiederfindung Methodenvergleich höchste getesteten Substanz Kreuzreaktivität Konzentration Prednisolon * 11-Deoxycortisol ** Cortison Kreuzreaktivität aller anderen getesteten Substanzen: < 1.0 % (höchste Konzentration µg/dl aufgestockt je Kreuzreaktand) 6β-Hydroxycortisol, Prednison, Androstenedion, Estron, Estriol, Medroxyprogesteron 17- acetate, 17α -Hydroxyprogesteron, Dehydroisoandrosteron, Pregnenolon, Medroxyprogesteron, 4,5α-Dihydrotestosteron, Progesteron, Corticosteron, Dexamethason, Testosteron, Androsteron, Dihydrotestosteron, Methyltestosteron, 19-Norethindron, Ethynylestradiol, Epiestriol, ß-Estradiol. *At 10% Prednisolon ist eine potenziell störende Substanz (ab 10000µg/dL). **At 5% 11-Deoxycortisol ist eine potenziell störende Substanz (ab 10000µg/dL). Mittleres Signal (Nullstandard) - 2SD Die Studie zur Nachweisgrenze des Blank (LoB) wurde in drei Tagen von µg/dl einer Person durchgeführt. Die Versuche wurden mit hohen und niedrigen Kit-Kontrollen und mit fünf verschiedenen Proben durchgeführt. Jede Probe wurde fünfmal in Doppelbestimmung mit zwei Reagenzienchargen getestet. Mittelwert Konz. < 20 % VK Die Studie zur Nachweisgrenze LoD/LoQ wurde in drei Tagen von einer µg/dl Person durchgeführt. Die Versuche wurden mit hohen und niedrigen Kit- Kontrollen und mit fünf verschiedenen humanen Salivaproben durchgeführt. Jede Probe wurde fünfmal in Doppelbestimmung mit zwei Reagenzienchargen getestet. Konz. unverdünnt Höchste Verdünnungsstufe Wfdg. Bereich Wfdg. Mittelwert : Die Studie zur Linearität wurde in zwei Tagen von einer Person durchgeführt. Die Versuche wurden mit hohen und niedrigen Kit-Kontrollen und mit zwei unterschiedlichen, miteinander gemischten, humanen Salivaproben durchgeführt. Jede Probe wurde in Doppelbestimmung mit einer Reagenziencharge getestet. ermittelte Cortisolkonzentration = x (erwartete Cortisol Konzentration ), r 2 = 0.99 Linearer Bereich des Assays ist bis zu µg/dl Die Studie zur Wiederfindung wurde an einem Tag von einer Person durchgeführt. Die Versuche wurden mit hohen und niedrigen Kit-Kontrollen und mit drei verschiedenen humanen Salivaproben, welche mit sechs unterschiedlichen Cortisolkonzentrationen versehen wurden, durchgeführt. Jede Probe wurde in Doppelbestimmung mit einer Reagenziencharge getestet. Konz. Bereich Konz. Zugefügt Wfdg. Bereich Wfdg. Mittelwert Die Studie zum Methodenvergleich wurde in fünf Tagen von einer Person durchgeführt. Die Versuche wurden mit hohen und niedrigen Kit-Kontrollen und mit verschiedenen humanen Salivaproben durchgeführt. Jede Probe wurde in Doppelbestimmung mit einer Reagenziencharge getestet. IBL-Assay = x ELISA r Pearson = n = 169 IBL-Assay = x LCMS Data r Pearson = n = 85 Version / 7

8 Präzision und Reproduzierbarkeit Die Studie zur Präzision und Reproduzierbarkeit wurde nach einem Tag Einarbeitung nach zwanzig Testtagen abgeschlossen. Pro Tag wurden 6 Läufe mit hohen und niedrigen Kit-Kontrollen und einem Panel aus 7 humanen Salivaproben durchgeführt. Jede Probe wurde mit drei verschiedenen Reagenzienchargen in Dreifachbestimmung pro Lauf von drei Personen getestet. Saliva Probe Mittelwert Konz. innerhalb Testlauf SD VK zwischen den Testläufen SD VK zwischen den Testtagen SD VK Totale Präzision = Präzision innerhalb des Labors SD % % % % % % % % % % % % % % % % % % % % % % % % % % % % Die Präzision zwischen den Reagenzienlots liegt im VK Bereich von 0.4 bis 1.7% für humane Salivaproben mit sieben unterschiedlichen Konzentrationen. Die Präzision zwischen den Anwendern liegt im VK Bereich von 0.8 bis 1.8% für humane Salivaproben mit sieben unterschiedlichen Konzentrationen. 17. LITERATUR ÜBER DAS PRODUKT 1. Clow, A.; Hucklebridge, F.; Stalder, T.; Evans, P.; Thorn, L. (2010): The cortisol awakening response: more than a measure of HPA axis function. In Neurosci Biobehav Rev 35 (1), pp Kalman, B.A; Grahn, R.E (2004): Measuring salivary cortisol in the behavioral neuroscience laboratory. In J Undergrad Neurosci Edu 2, pp. A41-A Kirschbaum, C.; Kudielka, B. M.; Gaab, J.; Schommer, N. C.; Hellhammer, D. H. (1999): Impact of gender, menstrual cycle phase, and oral contraceptives on the activity of the hypothalamus-pituitary-adrenal axis. In Psychosom Med 61 (2), pp Kirschbaum, C. (2010): Trier Social Stress Test. In Encyclopedia of Psychopharmacology, pp Laudat, M. H.; Cerdas, S.; Fournier, C.; Guiban, D.; Guilhaume, B.; Luton, J. P. (1988): Salivary cortisol measurement: a practical approach to assess pituitary-adrenal function. In J Clin Endocrinol Metab 66 (2), pp Lewis, J. G. (2006): Steroid analysis in saliva: an overview. In Clin Biochem Rev 27 (3), pp Liening, S. H.; Stanton, S. J.; Saini, E. K.; Schultheiss, O. C. (2010): Salivary testosterone, cortisol, and progesterone: two-week stability, interhormone correlations, and effects of time of day, menstrual cycle, and oral contraceptive use on steroid hormone levels. In Physiol Behav 99 (1), pp Nicolson, N.A (2008): Measurement of cortisol. In Handbook of physiological research methods in health psychology, pp Piazza, JR; Almeida, D. M.; Dmitrieva, N. O.; Klein, L. C. (2010): Frontiers in the use of biomarkers of health in research on stress and aging. In J Gerontol B Psychol Sci Soc Sci 65 (5), pp Raff, H.; Raff, J. L.; Findling, J. W. (1998): Late-night salivary cortisol as a screening test for Cushing's syndrome. In J Clin Endocrinol Metab 83 (8), pp Shimada, M.; Takahashi, K.; Ohkawa, T.; Segawa, M.; Higurashi, M. (1995): Determination of salivary cortisol by ELISA and its application to the assessment of the circadian rhythm in children. In Horm Res 44 (5), pp Tunn, S.; Mollmann, H.; Barth, J.; Derendorf, H.; Krieg, M. (1992): Simultaneous measurement of cortisol in serum and saliva after different forms of cortisol administration. In Clin Chem 38 (8 Pt 1), pp Aardal, E., Holm, A. (1995): Cortisol in Saliva Reference Ranges and Relation to Cortisol in Serum. Eur J Clin Chem Clin Biochem, 33(12), VK Version / 7

9 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Rx only Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθμός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Prescription use only. / Anwendung nach Verordnung. / Prescription utilisation seulement. / Receta usar solamente. / Prescrizione utilizzare solo. / Prescrição usar apenas. / Συνταγή χρήση μόνο. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. COMPLAINTS: Complaints may be submitted initially written or vocal. Subsequently they need to be filed including the test performance and results in writing in case of analytical reasons. WARRANTY: The product is warranted to be free from material defects within the specific shelf life and to comply with product specifications delivered with the product. The product must be used according to the Intended use, all instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. LIMITATION OF LIABILITY: IN ALL CIRCUMSTANCES THE EXTENT OF MANUFACTURER S LIABILITY IS LIMITED TO THE PURCHASE PRICE OF THE KIT(S) IN QUESTION. IN NO EVENT SHALL MANUFACTURER BE LIABLE FOR ANY INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING DAMAGES FOR LOST PROFITS, LOST SALES, INJURY TO PERSON OR PROPERTY OR ANY OTHER INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL LOSS. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Symbols Version 4.7 /