Erfahrungen mit den neuen mikrobiologischen Untersuchungsparametern nach EU-Badegewässerrichtlinie 2006/7/EG. Dr. Alfons Hack

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1 Erfahrungen mit den neuen mikrobiologischen Untersuchungsparametern nach EU-Badegewässerrichtlinie 2006/7/EG Dr. Alfons Hack Hessisches Landesprüfungs- und Untersuchungsamt im Gesundheitswesen Erfahrungsaustausch Badegewässer Friedberg

2 Empfehlung zur praktischen Umsetzung der EG-Badegewässerrichtlinie (UBA 2009) Die Publikation ist ausschließlich als Download beim UBA verfügbar. Herausgeber: Umweltbundesamt Postfach Dessau-Roßlau Tel.: 0340/ Telefax: 0340/ Internet: Redaktion: Dr. Regine Szewzyk Dessau-Roßlau, Juli 2009

3 Inhalt der UBA-Empfehlung zur praktischen Umsetzung der EG-Badegewässerrichtlinie 1. Konformitätsbestimmung in der Übergangszeit - E. coli - Intestinale Enterokokken 2. Angabe der Untersuchungsergebnisse, Vergleichbarkeit mikrobiologischer Untersuchungsverfahren 3. Wahl der Verdünnungen bei den MPN-Verfahren 4. Bedingungen bei Anwendung der Membranfiltration 5. Umgang mit Werten unter- und oberhalb der Nachweisbzw. der Bestimmungsgrenze

4 Referenzmethoden Parameter (Dimension) Norm Methodik Intestinale Enterokokken (KBE/100 ml) Escherichia coli (KBE/100 ml) DIN EN ISO DIN EN ISO DIN EN ISO (DIN EN ISO ) * MPN MF MPN (MF) MPN = Most-Probable-Number-Verfahren MF = Membranfiltrations-Verfahren * = Die Methode ist nicht in die deutsche Musterverordnung des Bund-Länder-Arbeitskreises "Badegewässer" und in die hessische Badegewässerverordnung von aufgenommen worden. Sie ist für Wasser mit hohem Keimgehalt nicht geeignet.

5 Membranfiltration Membranfilter, Porengröße 0,4 µm Edelstahlfritte Absaugvorrichtung Abstellhahn

6 Nachweis und Zählung von Intestinalen Enterokokken DIN EN ISO :2000 (Membranfiltration) Membranfiltration Inkubation auf Enterokokken-Agar nach Slanetz und Bartley 44 4 h bei 36 C Charakteristische Kolonien erfassen (Kolonie erhaben, rot, kastanienbraun oder rosa im Zentrum oder insgesamt Verdacht auf Enterokokken) Filter auf Galle-Äsculin-Azid Agar transferieren und 2 h bei 44 C inkubieren Gelbbraune bis schwarze Färbung im umgebenden Medium Intestinale Enterokokken!

7 Enterokokkennachweis DIN EN ISO Filteroberseite Anzuchtkultur auf Slanetz-Bartley-Agar Identifizierung auf Galle-Aeskulin-Agar Slanetz-Bartley-Agar Galle-Aeskulin-Agar Filterrückseite

8 Varianten des Membranfiltrationsverfahrens Kenngrößen A B bei Wasserqualität konstant sehr gut oder gut C bei Wasserqualität ausreichend oder schlechter Ansatzvolumen (ml) Untere Bestimmungsgrenze (KBE/100 ml) Obere Bestimmungsgrenze (KBE/100 ml) Anwendung nicht empfohlen im Regelfall bei erwarteter Verschmutzung zusätzlich zu B

9 Miniaturisiertes MPN-Verfahren DIN EN ISO und DIN EN ISO Multipipette mit sterilen Spitzen Probe original Petrischale mit Probe 1:2 bzw. 1:20 verdünnt Mikrotiterplatte mit Nährsubstrat

10 Bestimmung von Escherichia coli und Intestinalen Enterokokken mittels MPN-Verfahren Probenverdünnungen im allgemeinen 1:2 oder (1:2 und 1:20) Mikrotiterplatten füllen (200 µl / Vertiefung): 96 x 1:2-Verdünnung oder 64 x 1:2-Verdünnung + 32 x 1:20-Verdünnung Escherichia coli: Nährmedium mit 4-Methylumbelliferyl-ß-D-Glucuronid (MUG). Inkubation bei 44 C mindestens 36 h, höchstens 72 h Intestinale Enterokokken: Nährmedium mit 4-Methylumbelliferyl-ß-D-Glucosid (MUD). Inkubation bei 44 C mindestens 36 h, höchstens 72 h Ablesung unter UV-Licht (366 nm) Blaue Fluoreszenz E. coli bzw. Enterokokken Charakteristische Zahl Ablesen der Wahrscheinlichkeitszahl MPN Ergebnisangabe als KBE / 100 ml (wissenschaftlich korrekt: MPN / 100 ml)

11 MPN-Test auf E. coli 1:2-Verdünnung 10 von 96 positiv MPN-Tabelle: KBE / 100 ml 95%-Intervall:

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13 Varianten des Mikrotiterverfahrens Kenngrößen Ansatz bei Wasserqualität konstant sehr gut, konstant gut Ansatz bei Wasserqualität ausreichend, mangelhaft Verdünnung(en) 1:2 1:2 und 1:20 MT-Platten-Ansatz, Verdünnungen Untere Bestimmungsgrenze (KBE/100 ml) Obere Bestimmungsgrenze (KBE/100 ml) Angabe bei vermeidbarer Überschreitung (UBA) * 96 x 1:2 64 x 1:2 32 x 1:20 < 10 < Ist auf Grund äußerer Umstände, der Wetterlage oder auf Grund bisheriger Erfahrungen damit zu rechnen (z.b. bei kurzzeitigen Verschmutzungen oder Havarien), dass die obere Bestimmungsgrenze von KBE/100 ml überschritten wird, ist die Untersuchung von Anfang an mit den zwei Verdünnungsstufen 1:2 und 1:20 durchzuführen (UBA, Juli 2009). *

14 Grenzwerte für Binnengewässer KBE/100 ml (Perzentil) Parameter Ausgezeichnete Gute Ausreichende Qualität Qualität Qualität Intestinale Enterokokken 200 (95-%) 400 (95-%) 330 (90-%) E. coli 500 (95-%) 1000 (95-%) 900 (90-%)

15 Maßnahmen bei hohen Einzelwerten Verordnung über die Qualität und die Bewirtschaftung der Badegewässer (VO-BGW) Wird bei der Badegewässerüberwachung für den Parameter Escherichia coli ein Einzelwert von mehr als KBE/100 ml oder für den Parameter Intestinale Enterokokken ein Einzelwert von mehr als 700 KBE/100 ml festgestellt, so ist eine sofortige Nachkontrolle durchzuführen. Werden die Werte wieder überschritten, wird ein zeitweiliges Badeverbot erlassen. Empfehlung der Badewasserkommission Musterverordnung des BLAK Das Verbot ist aufzuheben, wenn der geometrische Mittelwert von mindestens drei an repräsentativen Stellen des Badegewässers entnommenen Wasserproben (oder das Ergebnis einer flächenintegrierten Probenahme von mindestens drei Stellen) einen Wert von unter 280 KBE/100 ml bei Escherichia coli und unter 100 KBE/100 ml bei den Intestinalen Enterokokken ergeben hat.

16 Bedingung für die Aufhebung von Badeverboten Wenn durch Messungen festgestellt wird, dass mindestens wieder ausreichende Qualität vorliegt. I. Bewertung mittels 90-Perzentil: < 900 KBE/100 ml (E. coli) < 330 KBE/100 ml (Enterokokken) Es sind relativ viele Proben nötig. II. Bewertung mittels 50-Perzentil (= Median, geom. Mittel): < 280 KBE/100 ml (E. coli) < 100 KBE/100 ml (Intestinale Enterokokken) Es sind nur wenige Proben nötig (mindestens 3).

17 Ringversuchsergebnisse des NLGA EU-Badegewässermikrobiologie E. coli Ringversuch MPN KBE/100 ml I/2008 Ausschlussgrenze unten 694 Mittelwert Ausschlussgrenze oben III/2008 Ausschlussgrenze unten 87 Mittelwert 228 Ausschlussgrenze oben 431 II/2009 Ausschlussgrenze unten 207 Mittelwert 480 Ausschlussgrenze oben 856

18 Ringversuchsergebnisse des NLGA EU-Badegewässermikrobiologie Intestinale Enterokokken RV Kenngrößen MPN KBE/100 ml MF KBE/100 ml I/2008 Ausschlussgrenze unten Mittelwert Ausschlussgrenze oben III/2008 Ausschlussgrenze unten Mittelwert Ausschlussgrenze oben II/2009 Ausschlussgrenze unten Mittelwert Ausschlussgrenze oben Bebrütungstemperatur 44 C 36 C Eigene Untersuchungen an realen Proben bestätigen im Grundsatz die Diskrepanz zwischen den Ergebnissen der beiden Untersuchungsverfahren. MPN < MF

19 Enterokokken KBE / 100 ml Konzentrationen intestinaler Enterokokken im Wasser aus mittelhessischen Badeseen und Fließgewässern im Sommer Vergleich der Membranfiltermethodik mit dem MPN-Verfahren DIN-Methoden log MF > MPN : 25 Proben MF < MPN : 12 Proben 1000 Filter SB MPN DIN Die relativen Standardabweichungen der Methodik wurden an Vergleichsproben aus Dill und Dietzhölze ermittelt (jeweils n = 8) Bei Werten unter der Bestimmungsgrenze wurden die Werte der Bestimmungsgrenze für die Darstellung verwendet.

20 E. coli KBE / 100 ml E. coli-konzentrationen im Wasser aus mittelhessischen Badeseen und Fließgewässern im Sommer Vergleich der Membranfiltermethodik mit dem MPN-Verfahren - DIN Methoden log Filter TTC MPN DIN Die relativen Standardabweichungen der Methodik wurden an Vergleichsproben aus Dill und Dietzhölze ermittelt (jeweils n = 8) Bei Werten unter der Bestimmungsgrenze wurden die Werte der Bestimmungsgrenze für die Darstellung verwendet.

21 Konformitätsüberprüfung Für jedes Badegewässer am Ende der Badesaison Grundbedingung: ausreichend viele Bestimmungen von E. coli und Intestinalen Enterokokken Erste Messung kurz vor Beginn der Saison und mindestens monatlich weitere Messungen bis zum Ende der Saison Bewertung 2010 noch nach den Regeln für die Übergangszeit Bewertung bis spätestens zum Jahr 2011 (BRD) auf der Basis von Daten der letzten vier Jahre nach den neuen Regeln, d.h. Beurteilung anhand von - 95-Perzentil (sehr gute Qualität und gute Qualität) - 90-Perzentil (ausreichende Qualität)

22 Alternative Untersuchungsmethoden Alternative Untersuchungsmethoden sind zulässig. Die Gleichwertigkeit damit erzielter Ergebnisse mit den Ergebnissen der Referenzmethoden ist zu belegen. Die Kommission verlangt Prüfung nach DIN EN ISO 17994:2004. Das Umweltbundesamt stellt die Gleichwertigkeit fest. Es veröffentlicht darüber eine Liste im Bundesgesundheitsblatt. Zur Zeit ist noch keine Alternativmethode verfügbar.

23 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!