10. Übung. Vorlesung Einführung in die Bioinformatik für Biochemiker

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1 Prof. Dr. Oliver Kohlbacher Nora Toussaint, Andreas Bertsch Fakultät für Informations- und Kognitionswissenschaften Abteilung für simulation biologischer Systeme Zentrum für Bioinformatik Tübingen 10. Übung zur Vorlesung Einführung in die Bioinformatik für Biochemiker Bitte legen Sie vor der Übung ein Verzeichnis an, in das Sie alle Dateien dieser Übung speichern. Löschen Sie bitte dieses Verzeichnis bevor Sie gehen, damit die späteren Übungsgruppen einen aufgeräumten Rechner vorfinden. Vielen Dank. Aufgabe 1: Das Webinterface der PDB Besuchen Sie die Website der Protein Data Bank unter und machen Sie sich mit dem User-Interface vertraut. Auf der Startseite finden Sie eine Suchmaske, in der Sie nach IDs, Volltext oder Autorennamen suchen können. Für die meisten Anwendungen reicht dies aus. Für komplexere Suchen gibt es auch eine erweiterte Suchmaske, in der Sie z.b. nach experimenteller Methode (XRD, NMR) oder Auflösung suchen können. Machen Sie sich mit der Suchfunktion und der Navigation vertraut, indem Sie nach der PDB-ID 4PTI suchen. Um was für ein Protein handelt es sich? Welchem Organismus entstammt es? Welche Auflösung hat die Struktur? Wieviele Aminosäuren sind darin enthalten? Wie lautet die Sequenz des Proteins? Erkunden Sie nun die Volltextsuche: Suchen Sie nach menschlichem Serumalbumin. Welche Auflösung hat diese Struktur? Unter Geometry können Sie sich u.a. den Ramachandran-Plot des Proteins anzeigen lassen. Über More Images... können Sie sich Bilder der Struktur ansehen. Sie erhalten die entsprechende PDB-Datei über Download Files rechts oben neben der PDB-ID der Struktur. Aufgabe 2: Das PDB-Format Das PDB-Dateiformat zur Speicherung kristallographischer Moleküldaten ist ein spaltenbasiertes Format, das strikt vorschreibt, in welcher Textspalte welche Daten zu finden sind. Eine Kurzübersicht darüber, welche Records und Spalten welche Information enthalten, finden Sie im Anhang dieses Übungsblatts. Detailinformationen zur Bedeutung der einzelnen Records und Spalten im PDB-Format finden Sie unter Hevein, das Ihnen bereits hinlänglich bekannte Latexallergen, besitzt 43 Aminosäuren. Es wurden davon sowohl NMR- als auch Kristallstrukturen bestimmt.

2 Suchen Sie mit der erweiterten Suche der PDB nach Hevein und laden Sie je eine PDB-Datei mit NMRund XRD-Struktur herunter. Vergleichen Sie die Größe der Dateien (Tipp: ls -l). Warum ist die eine Datei soviel größer, wenn es sich um das gleiche Molekül handelt? Öffnen Sie die Kristallstruktur in einem Texteditor. Wieviele Schwefelbrücken gibt es in der Struktur? Suchen Sie zur ersten Schwefelbrücke die ATOM-Records der SG-Atome der beteiligten Cysteine. Wieviele Wassermoleküle sind in der Struktur enthalten? Warum fehlen in der Struktur die Wasserstoffe der Wasseratome? Warum fehlen die Wassermoleküle in der NMR-Struktur ganz? Aufgabe 3: Starten von BALLView Die Dokumentation zu BALLView finden Sie im WWW unter BALLView lässt sich auf den Pool-Rechnern durch Eingabe von BALLView starten. Es öffnet sich ein Fenster mit mehreren Unterfenstern: 1. Das Unterfenster Structures bietet eine hierarchische Übersicht über die geladenen Moleküle und ermöglicht die Interaktion mit Molekülelementen. 2. Im Unterfenster Representations verwaltet man die grafischen Darstellungen ( Repräsentationen ) von Molekülen bzw. Teilen von Molekülen. 3. Im Unterfenster 3D-View werden die geladenen Moleküle visualisiert. Alle aktivierten Repräsentationen werden dargestellt. Alle anderen Fenster, wie z.b. Logs und Python Interpreter, können Sie schließen. Im Hilfe-Menü von BALLView finden Sie ein kurzes Tutorial, das Sie durcharbeiten sollten. Die 3D-Ansicht hat vier Modi: Im Rotate Mode kann das dargestellte Molekül mit der Maus bewegt werden. Im Picking Mode können Elemente des Moleküls per Mausklick ausgewählt werden. Selektierte Elemente werden gelb dargestellt. Im Structures-Fenster erscheint ein Häkchen neben den ausgewählten Element. Auf diese Weise können Molekülelemente identifiziert werden. Der Move Mode ermöglicht es, ausgewählte Atome zu bewegen. Im Edit Mode können Atome und Atombindungen eingefügt, verändert und gelöscht werden. Über das Display-Menü können Sie von einem Modus in einen anderen wechseln. Zu Beginn befindet man sich im Rotate Mode. Machen Sie sich mit der Maussteuerung der 3D-Ansicht von BALLView vertraut. Öffnen Sie die Kristallstruktur von Hevein mit BALLView über das Menü. Bewegen Sie das Molekül (Rotate Mode): Linksklicken und Ziehen rotiert das Molekül. Shift-Linksklick und Ziehen zoomt hinein und heraus. Rechtsklick und Ziehen verschiebt es in der X-Y-Ebene. Shift-Strg-Linksklick und Ziehen rotiert es um die Z-Achse. Selektieren Sie einzelne Elemente oder Bereiche des Moleküls (Picking Mode). Ein Linksklick auf ein Element selektiert dieses. Durch Linksklick und Ziehen können ganze Bereiche selektiert werden. Durch Rechtsklick können Elemente deselektiert werden. 2

3 Aufgabe 4: Darstellungsarten in BALLView Durch einen Rechtsklick auf ein Modell im Representations-Fenster erhalten Sie das Kontextmenü. Über den Punkt Modify Model können Sie verschiedene Darstellungsarten auswählen. Die wichtigsten Darstellungsarten sind: Line zeichnet Bindungen als einfache Striche. Sticks zeichnet Bindungen als Stäbe (Stick-Darstellung). Ball & Stick zeichnet Atome als Kugeln und Bindungen als Stäbe. SES Oberflächendarstellung für die sogenannte solvent excluded surface (SES). Diese Oberfläche repräsentiert die für das Lösemittel (normalerweise Wasser) gerade nicht mehr zugängliche Oberfläche des Molekküls. SAS Oberflächendarstellung für die sogenannte solvent accessible surface (SAS). Diese Oberfläche reprääsentiert die fürür s Lösemittel zugängliche Oberfläche. Backbone zeichnet das Proteinrückgrat als Tubus. Cartoon zeichnet Sekundärstrukturelemente: Helices als Zylinder, Faltblätter als breite Pfeile. Zusätzlich zur Darstellungsart kann man über den gleichen Dialog auch die Farbe der Darstellung beeinflussen. Durch Farbe kann man wesentliche Informationen im Modell darstellen, die sonst nur schwer darstellbar sind, z.b. Temperaturfaktoren, Ladung usw. BALLView stellt unter anderem die folgenden Farbschemata zur Verfügung: by element ist selbsterklärend. by residue index färbt die Seitenketten entsprechend ihrer laufenden Nummer auf einer Regenbogenskala, so dass man den sequentiellen Verlauf der Seitenketten gut erkennen kann. by chain färbt die erste CHAIN des PDB-Files in einer Farbe, die zweite in einer anderen usw. by secondary structure färbt die Darstellung nach der Zugehörigkeit einzelner Bereiche des Proteins zu Sekundärstrukturelementen (Faltblätter, Helices, Loops). by temperature factor färbt nach Temperaturfaktor der Kristallstruktur. by residue type färbt nach Aminosäuretyp. custom erlaubt die Färbung mit einer vom Benutzer festgelegten Farbe. Nicht jedes der Farbschemata lässt sich mit jeder Darstellung kombinieren. Probieren Sie verschiedene Kombinationen von Schemata und Färbungen aus. Aufgabe 5: Anwenden von BALLView Ziehen Sie für diese Aufgabe die BALLView-Dokumentation im Internet zu Rate. Laden Sie über die Download-Funktion von BALLView die Struktur 1Q9B von der PDB herunter. Stellen sie das Molekül als Backbone dar. Färben Sie den Backbone nach Aminosäuretyp. Alle schwefelhaltigen AS sind dann grau, alle Glycine pink usw. Selektieren Sie alle Atome in Cysteinen. Hinweis: In BALLView ist es möglich, Molekülelemente über reguläre Ausdrücke zu selektieren. Dazu trägt man den Ausdruck in das Textfeld im Structures-Unterfenster ein und wählt Select. Ein solcher Ausdruck besteht aus einem Prädikat, das eine Eigenschaft definiert (Name des Atoms, Aminosäuretyp,... ) und einem Wert, der für diese Eigenschaft gelten soll. Drücken Sie den Help -Knopf unterhalb des Textfelds, um die Liste der möglichen Prädikate zu sehen. Bedenken Sie, dass Aminosäuren durch ihren Dreibuchstabencode bezeichnet werden und dass dieser Code mit Großbuchstaben gebildet wird. Kreieren Sie für die selektierten Cysteine eine Darstellung, die atomare Details anzeigt. Benutzen Sie dabei eine Färbung, die Atome nach ihrem Element färbt. Können Sie die Schwefelbrücken erkennen? Wieviele sehen Sie? Blenden Sie die aktuellen Darstellungen aus und kreieren Sie eine Ball-and-Stick-Darstellung für das gesamte Protein. Färben Sie in dieser Darstellung alle C α -Atome grün und alle restlichen Atome rot. 3

4 Aufgabe 6: Visualisierung von Strukturdetails Eine der in der Strukturbioinformatik bekanntesten Proteinstrukturen ist der Komplex aus Trypsin und dem Trypsininhibitor aus dem Pankreas des Rinds. Sie finden diese Struktur in der PDB unter der ID 2PTC. Speichern Sie die Struktur des Komplexes aus der PDB auf Ihrem Rechner ab. Visualisieren Sie den Komplex mit BALLView. Identifizieren Sie Trypsin und den Inhibitor. Färben Sie die Struktur derart, dass Trypsin und Inhibitor unterscheidbar sind. Visualisieren Sie das Enzym mit einer SES-Oberfläche, der sie eine einheitliche Farbe zuweisen. Visualisieren Sie den Inhibitor mit einem Modell, das atomare Details erkennen lässt. Färben Sie dieses Modell auch in einer einheitlichen Farbe, die gut zu der des Enzyms kontrastiert. Schauen Sie sich in dieser Darstellung die Bindungstasche des Enzyms genauer an. Sie werden sehen, dass eine Seitenkette des Inhibitors sehr weit in diese Bindungstasche hineinragt. Um was für eine Aminosäure handelt es sich? An welcher Position steht diese Aminosäure in der Sequenz des Inhibitors? Tipp: Im Picking Mode können Sie einzelne Atome selektieren. (Hier müssen Sie ggf. ein wenig Geduld haben.) Wenn Sie während des Selektierens das Fenster Logs offen haben, erfahren Sie in diesem ein paar Einzelheiten über das selektierte Atom. Wenn Sie ein Atom selektiert haben, kann Ihnen außerdem die Funktion Highlight Selection im Kontextmenü im Structures -Fenster weiterhelfen. Bitte löschen Sie die von Ihnen angelegten oder heruntergeladenen Dateien bevor Sie gehen und vergessen Sie Ihre Unterschrift nicht. Danke. 4

5 COLUMNS DATA TYPE FIELD DEFINITION Record name "ATOM " 7-11 Integer serial Atom serial number Atom name Atom name. 17 Character altloc Alternate location indicator Residue name resname Residue name. 22 Character chainid Chain identifier Integer resseq Residue sequence number. 27 AChar icode Code for insertion of residues Real(8.3) x Orthogonal coordinates for X in Angstroms Real(8.3) y Orthogonal coordinates for Y in Angstroms Real(8.3) z Orthogonal coordinates for Z in Angstroms Real(6.2) occupancy Occupancy Real(6.2) tempfactor Temperature factor LString(4) segid Segment identifier, left-justified LString(2) element Element symbol, right-justified LString(2) charge Charge on the atom. PDB-Format Abbildung 1: Definition der Spalten des ATOM Koordinateneintrags Das PDB-Dateiformat zur Speicherung kristallographischer Moleküldaten ist ein spaltenbasiertes Format, das aus der Welt der Kristallographen stammt und strikt vorschreibt, in welcher Spalte welche Daten zu finden sind. Dabei definiert ein Schlüsselwort in der ersten Spalte, welche Art von Datensatz in der aktuellen Zeile steht. Beispielsweise werden Atome und deren Positionen in Zeilen definiert, die mit dem Schlüsselwort ATOM beginnen. Eine solche Zeile enthält neben den Koordinaten des jeweiligen Atoms eine laufende Nummer, Informationen über den Atomtyp, den Namen der Aminosäure, zu der dieses Atom gehört, etc. Es gibt eine Menge verschiedener Records, die Aspekte eines Moleküls definieren, von Atomen über Bindungen bis hin zu alternativen Konformationen des Moleküls. Uns interessiert im Moment nur die Definition von Atomen. In Abbildung 1 finden Sie die vollständige Definition des ATOM -Records. Will man mehrere Ketten (oder ebenfalls nicht standardkonform Moleküle) kodieren, so trennt man die Atomkoordinatensätze durch das Schlüsselwort TER. Zusätzlich zum ATOM -Record gibt es den HETATM -Record, der Atome definiert, die nicht zu einer proteinogenen Aminosäure oder DNA bzw. RNA gehören. Dazu gehören Atome des Lösemittels oder von nicht-proteinogenen Seitenketten bzw. Liganden, die nicht oder nur teilweise aus Aminosäuren bestehen. Ein typischer Protein-Ligand- Komplex hat dann in etwa folgende Struktur: ATOM 1 N VAL N ATOM 2 CA VAL C ATOM 3 C VAL C... 5

6 TER HETATM 1900 C1 NAG C HETATM 1901 C2 NAG C HETATM 1902 C3 NAG C... TER Besteht ein Protein aus mehreren Untereinheiten, so werden diese Ketten mit Buchstaben bezeichnet. In jedem Atom- Eintrag wird die Kettenzugehörigkeit an der dafür vorgesehenen Position im ATOM -Record festgehalten, nämlich in Spalte 22 (siehe wieder Abbildung 1). Detaillierte Beschreibungen darüber, welche Spalten welche Information enthalten, finden Sie in der Online-Doku der PDB. Hier sollen nur die wichtigsten Record-Typen kurz aufgezählt werden: ATOM Atom in einer Aminosäure/einem Nukleotid. Versehen mit einer durchgehenden Nummer, einem Namen, dem Namen und der Nummer des Restes in dem es enthalten ist, drei Koordinaten (x, y, z in Angstrom), einem Element (rechter Rand) HETATM Atom in einer Heterogruppe. Analog zu ATOM. SEQRES Sequenzinformation des Proteins. TER Ende einer Kette. MODEL Anfang eines neuen Strukturmodells. Insbesondere für NMR-Strukturfamilien, das erste Modell ist dabei meist die Durchschnittstruktur, dann folgen bis zu mehreren Dutzenden sinnvoller Alternativmodelle. ENDMDL Ende eines Strukturmodells. SSBOND Eintrag für eine Schwefelbrücke. Angegeben werden eine fortlaufende Nummer der Schwefelbrücke und die Namen (CYS) und Nummern der beiden an der Brücke beteiligten Aminosäuren. SOURCE Herkunftsorganismus des Proteins. EXPDTA Experimentelle Methode (NMR, XRD,...). JRNL Originalpublikation der Struktur. REMARK Zusatzinformationen als Fließtext. HELIX Beginn und Ende einer Helix in der Struktur. SHEET Beginn und Ende eines Faltblatts in der Struktur. ANISOU Anisotrope Temperaturfaktoren (aus der Röntgenstrukturanalyse). 6