Für die Isolierung genomischer DNS aus Abstrichtupfern, Blutkulturen, Serum, Plasma oder anderen Körperflüssigkeiten

Gebrauchsinformation / Instructions for use hyplex Prep Modul Für die Isolierung genomischer DNS aus Abstrichtupfern, Blutkulturen, Serum, Plasma oder anderen Körperflüssigkeiten To isolate genomic DNA from swabs, blood cultures, serum, plasma or other body fluids hyplex Prep Modul Best.-Nr./ Cat. No.: 3951 Gebrauchsinformation / Instructions for use: GIPM001.DOC gültig ab / valid from: Januar 2008 / January 2008

2 Inhaltsverzeichnis hyplex Prep Modul Seite 1. Packungsinhalt 3 2. Produktbeschreibung 4 2.1 Grundprinzip 4 2.2 Über diese Gebrauchsanweisung 4 2.3 Kit-Eigenschaften 4 2.4 Lagerung der Blutkultur-Proben 5 2.5 Elutionsverfahren 5 3. Lagerungsbedingungen und Herstellung der Arbeitslösungen 6 4. Protokolle zur DNS Aufreinigung mit dem hyplex Prep Modul 7 4.1 Reinigung genomischer DNS aus Abstrichtupfern/Körperflüssigkeiten 7 4.2 Reinigung genomischer DNS aus Blutkulturen 9 4.3 Reinigung genomischer DNS aus Trachealsekreten/Sputum 11 5. Anhang 13 5.1 Troubleshooting 13 5.2 Bestellinformationen 14 5.3 Produktverwertbarkeits - Einschränkung / Garantie 14 Erläuterungen der Symbole auf den Etiketten Explanation of symbols used in labeling Deutsch Lot Lot-Nummer Batch code Cat. No. Best.-Nr. Bestell-Nummer Verwendbar bis Englisch Catalogue number Use by R 22 36 / 38 S 22 Lagertemperatur Gesundheitsschädlich Temperature limitation Harmful Hinweis auf besomdere Gefahren und Sicherheitsratschläge (R- und S-Sätze) Nature of spezial risk and safty precautions (r- and S-codes) R 22 R 36/38 S 22 Gesundheitsschädlich beim Verschlucken / Harmful if swallowed Reizt die Augen und Haut / Irritate eyes and skin Staub nicht einamtmen / Don t inhale dust

3 Gebrauchsinformation hyplex Prep Modul Für die Isolierung genomischer DNS aus Abstrichtupfern, Blutkulturen, Serum, Plasma oder anderen Körperflüssigkeiten 1. Packungsinhalt 50 Präparationen Best.-Nr. 3951 Puffer B1 10 ml Reagenz B2 Puffer B5 (Konzentrat) Puffer BW Puffer BE hyplex Prep Säulen (plus Sammelbehälter) 2 ml Sammelbehälter Aufkleber für Puffer B3 Gebrauchsinformation 2,5 ml 7 ml 30 ml 13 ml 50 Stück 50 Stück 1 Stück 1 Stück Herstellung der Arbeitslösungen und Lagerbedingungen: siehe Abschnitt 3.

4 2. Produktbeschreibung 2.1 Grundprinzip Das hyplex Prep Modul erlaubt die Isolierung genomischer DNS aus Abstrichtupfern, Blutkulturen, Zellen aus Kulturen, Serum, Plasma oder anderen Körperflüssigkeiten. Die Zellen werden durch zehnminütige Inkubation der Proben bei 99 C in einer Lösung, die den hyplex Lyse-Puffer (Best.-Nr. 3950) enthält, lysiert. Die zur Bindung der DNS an die Silika-Membran der hyplex Prep Säulen notwendigen Bedingungen werden durch die Zugabe von Bindungspuffer und Ethanol zum Lysat erreicht. Dieser Bindungsprozess ist reversibel. Zusätzliche Waschschritte entfernen gründlich jegliche Kontamination. 2.2 Über diese Gebrauchsinformation Erfahrene Anwender, die die Isolierung genomischer DNS mit einem hyplex Prep Modul durchführen, können auch auf die Kurzanleitung anstelle dieser Gebrauchsanweisung zurückgreifen. Diese Kurzanleitung wurde lediglich als zusätzliches Hilfsmittel zur schnellen Information während der Durchführung der DNS-Reinigung konzipiert. Erstanwendern wird die gründliche Lektüre dieser Gebrauchsanweisung dringend empfohlen. 2.3 Kit-Eigenschaften Das hyplex Prep Modul wurde zur schnellen Isolierung von hochreiner, genomischer DNS aus Abstrichtupfern, Blutkulturen, Serum, Plasma und anderen Körperflüssigkeiten entwickelt. Die Aufreinigung viraler DNS (z. B. HBV) ist ebenfalls möglich. Da virale DNS zusammen mit zellulärer DNS aufgereinigt wird, empfehlen wir die Verwendung zellfreier Proben (Serum oder Plasma), um reine, virale DNS zu gewinnen. Das hyplex Prep Modul erlaubt die Reinigung hochreiner, genomischer DNS mit einem A 260/280 -Verhältnis zwischen 1,60 und 1,90 in einer Konzentration von 40 60 ng/µl. Die gewonnene DNS ist zum nachfolgenden Einsatz in PCR, Southern-Blot oder jeglicher Art von enzymatischer Reaktion geeignet.

5 2.4 Lagerung der Proben Vor der Isolierung der genomischen DNS aus positiven Blutkulturen mit dem hyplex Prep Modul können die Proben bei +4 C oder -20 C gelagert werden. Blutkultur-Proben, die bei +4 C oder -20 C einige Tage bzw. Wochen gelagert wurden, erlauben noch eine DNS-Isolierung. Es ist allerdings zu berücksichtigen, dass die Qualität der DNS und die Ausbeute mit zunehmender Lagerzeit der Blutkultur-Proben unter den angegebenen Bedingungen langsam abnehmen. Die beste Qualität und höchsten Ausbeuten erhält man stets mit frischen Blutkulturen. Andere Proben wie Urin, Trachealsekret, Sputum oder Abstrichtupfer sollten stets bei +4 C gelagert werden. Es ist allerdings zu berücksichtigen, dass auch in diesen Fällen die Qualität der DNS und die Ausbeute mit zunehmender Lagerzeit unter den angegebenen Bedingungen langsam abnehmen. 2.5 Elutionsverfahren Grundsätzlich ist es möglich, die Elutionsmethode und das Volumen des Elutionspuffers je nach nachfolgender Applikation zu variieren. Zusätzlich zu den Standardmethoden (Wiederfindungsrate ca. 70-90 %) gibt es einige mögliche Modifikationen. Für die folgenden Verfahren ist, falls nicht anders angegeben, ein auf 50 C vorgewärmter Elutionspuffer zu verwenden: Hohe Ausbeute: Den Elutionsschritt mit dem in der jeweiligen Methode angegebenen Elutionspuffer-Volumen zweimal durchführen. So können ca. 100 % der gebundenen Nukleinsäuren eluiert werden. Hohe Konzentration: Durchführung von einem Elutionsschritt mit 60 % des im jeweiligen Protokoll angegebenen Volumens. Die Konzentration der DNS ist dann höher als beim Standardverfahren (ca. 130 %). Die maximale Ausbeute an gebundener Nukleinsäure beträgt ca. 80 %. Hohe Ausbeute und hohe Konzentration: Verwendung der Hälfte des im jeweiligen Protokoll angegebenen Elutionspuffer-Volumens. 3 Minuten inkubieren und zentrifugieren. Die Schritte anschließend wiederholen. So können ca. 85 100 % der gebundenen Nukleinsäuren im Standard-Elutionsverfahren bei hoher Konzentration eluiert werden. Vereinfachte Elution: Zur Vereinfachung kann auch Elutionspuffer mit Umgebungstemperatur benutzt werden. Dies führt zu einer etwas geringeren Ausbeute (ca. 20 %) im Vergleich zum vorgewärmten Elutionspuffer.

6 Die Elution kann auch mit Tris-EDTA-Puffer (TE) mit einem ph 8 erfolgen. Dadurch erhöht sich die Stabilität der DNS während der Lagerung bei 4 C oder bei Raumtemperatur bei gleichzeitiger Inhibierung omnipräsenter DNasen über einen längeren Zeitraum hinweg oder bei häufiger Benutzung. Es ist jedoch zu berücksichtigen, dass EDTA, abhängig von der Endkonzentration, nachfolgende Anwendungen beeinflussen kann. Für eine optimale Verwendbarkeit der isolierten DNS für nachfolgende Applikationen empfehlen wir die Elution mit dem im Modul enthaltenen Elutionspuffer BE. Längerfristige Lagerung der isolierten DNS sollte bei -20 C erfolgen. Einige Auftau-Einfrier-Zyklen haben keinen Einfluss auf die Weiterverwendung. 3. Lagerungsbedingungen und Herstellung der Arbeitslösungen Achtung: Puffer B1, B3, und BW enthalten Guanidinhydrochlorid! Handschuhe und Schutzbrille tragen! Alle Modul-Komponenten können bei Raumtemperatur (20...25 C) gelagert werden und sind für ein Jahr ab Herstellungsdatum stabil. Vor dem Beginn der Präparation mit dem hyplex Prep Modul sind folgende Lösungen herzustellen: Puffer B5: 28 ml Ethanol p.a. (96-100 %) zum Puffer B5 Konzentrat hinzufügen. Der gebrauchsfertige Puffer B5 hat ein Volumen von 35 ml. Die Lagerung bei Raumtemperatur (20...25 C) ist bis zu einem Jahr ab Herstellungsdatum möglich. Herstellen von Puffer B3: Zugabe des gesamten Puffers B1 zum Reagenz B2. Gut durchmischen. Der so entstandene Puffer B3 ist bei Raumtemperatur für ein Jahr ab Herstellungsdatum stabil. Während der Lagerung, z.b. bei niedrigen Temperaturen, kann sich in den Puffern B3 oder B1 ein weißes Präzipitat bilden. Dieses ist vor Gebrauch durch Inkubation des Fläschchens bei 50 C zu lösen.

4. Protokolle zur DNS Aufreinigung mit dem hyplex Prep Modul 7 4.1 Reinigung genomischer DNS aus Abstrichtupfern / Körperflüssigkeiten Vor dem Beginn der Präparation den Inkubator auf 99 C erwärmen. Puffer BE bei 50 C equilibrieren. Puffer B3 und B5 vorbereiten (siehe Kapitel 3). 1 Vorbehandlung: Abstrichtupfer: In 200 µl hyplex Lyse-Puffer (Best.-Nr. 3950) kräftig ausquetschen (Empfohlen werden 2,0 ml Reaktionsgefäße mit Schraubdeckel). Körperflüssigkeiten: Flüssigkeit 10 min bei 12.000 x g zentrifugieren und Überstand verwerfen. Das Pellet in 200 µl hyplex Lyse-Puffer resuspendieren (Empfohlen werden 2,0 ml Reaktionsgefäße mit Schraubdeckel). 200 µl hyplex Lyse- Puffer Sperma: 100 µl Sperma mit 200 µl hyplex Lyse-Puffer mischen (Empfohlen werden 2,0 ml Reaktionsgefäße mit Schraubdeckel). 2 Proben lysieren Proben bei 99 C für 10 min inkubieren. 99 C; 10 min 3 Separation der Zellreste 2 min bei 10.000 x g abzentrifugieren und vom Überstand 200 µl in ein neues steriles Reaktionsgefäß pipettieren (Empfohlen werden 1,5 ml Reaktionsgefäße). 2min 200 µl Überstand 4 Einstellen der Bedingungen für die DNS Bindung 200 µl Puffer B3 zu jeder Probe hinzufügen und gut durchmischen. 210 µl Ethanol p.a. (96-100 %) zu jeder Probe hinzufügen und gut durchmischen. + 200 µl B3; mischen + 210 µl Ethanol; mischen

8 5 DNA Bindung Für jede Präparation eine hyplex Prep Säule, die sich in einem 2 ml Sammelbehälter befindet, verwenden und mit der Probe beladen. bei 10.000 g zentrifugieren. Falls die Probe nicht vollständig durch die Matrix in den Sammelbehälter tritt, die Zentrifugation bei höherer Umdrehungszahl wiederholen (max. bis 12.000 g). Sammelbehälter mit Durchfluss verwerfen. 6 Silika Membran waschen 1. Wäsche Die hyplex Prep Säule in einen neuen 2 ml Sammelbehälter geben und 500 µl Puffer BW zugeben. bei 10.000 x g zentrifugieren. Durchfluss verwerfen. 2. Wäsche Die hyplex Prep Säule zurück in den Sammelbehälter stellen und 600 µl Puffer B5 hinzugeben. bei 10.000 x g zentrifugieren. Durchfluss verwerfen. mit Lysat beladen 10.000 g + 500 µl BW 10.000 x g + 600 µl B5 10.000 x g 7 Silika Membran trocknen Die hyplex Prep Säule zurück in den Sammelbehälter stellen und bei 10.000 x g zentrifugieren. 10.000 x g Bei diesem Schritt wird das restliche Ethanol entfernt. 8 Hochreine DNS eluieren Die hyplex Prep Säule in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß geben und 100 µl vorgewärmten Elutionspuffer BE (50 C) hinzufügen. Den Puffer direkt auf die Silika Membran pipettieren. bei Raumtemperatur inkubieren. bei 10.000 x g zentrifugieren. Alternative Elutionsverfahren: siehe Kapitel 2.5 + 100 µl BE (50 C) RT 10.000 x g

4.2 Reinigung genomischer DNS aus Blutkulturen 9 Vor dem Beginn der Präparation den Inkubator auf 99 C erwärmen. Puffer BE bei 50 C equilibrieren. Puffer B3 und B5 vorbereiten (siehe Kapitel 3). 1 Vorbehandlung: 1-2 ml Blutkultur-Flüssigkeit in ein steriles Filtrationsfläschchen (Best.-Nr. 3957) geben und gut mischen. Die ersten 5 Tropfen verwerfen. 1-2 ml in ein steriles Reaktionsgefäß tropfen. 2 min zentrifugieren bei 10 000 g, Überstand verwerfen. Pellet mit 200 µl hyplex Lyse-Puffer (Best.-Nr. 3950) resuspendieren. 2 Proben lysieren Proben bei 99 C für 10 min inkubieren. 1-2 ml Blutkultur mischen 5 Tropfen verwerfen 1-2 ml in RG 200 µl hyplex Lysepuffer 99 C; 10 min 3 Separation der Zellreste 2 min bei 10.000 x g abzentrifugieren und vom Überstand 200 µl in ein neues steriles Reaktionsgefäß pipettieren (Empfohlen werden 1,5 ml Reaktionsgefäße). 2min 200 µl Überstand 4 Einstellen der Bedingungen für die DNS Bindung 200 µl Puffer B3 zu jeder Probe hinzufügen und gut durchmischen. 210 µl Ethanol p.a. (96-100 %) zu jeder Probe hinzufügen und gut durchmischen. + 200 µl B3 + 210 µl Ethanol mischen

10 5 DNS Bindung Für jede Präparation eine hyplex Prep Säule, die sich in einem 2 ml Sammelbehälter befindet, verwenden und mit der Probe beladen. bei 10.000 g zentrifugieren. Falls die Probe nicht vollständig durch die Matrix in den Samelbehälter tritt, die Zentrifugation bei höherer Umdrehungszahl wiederholen (max. bis 12.000 g). Sammelbehälter mit Durchfluss verwerfen. mit Lysat beladen 10.000 g 6 Silika Membran waschen 1. Wäsche Die hyplex Prep Säule in einen neuen 2 ml Sammelbehälter geben und 500 µl Puffer BW zugeben. bei 10.000 x g zentrifugieren. Durchfluss verwerfen. 2. Wäsche Die hyplex Prep Säule zurück in den Sammelbehälter stellen und 600 µl Puffer B5 hinzugeben. bei 10.000 x g zentrifugieren. Durchfluss verwerfen. + 500 µl BW 10.000 x g + 600 µl B5 10.000 x g 7 Silika Membran trocknen Die hyplex Prep Säule zurück in den Sammelbehälter stellen und bei 10.000 x g zentrifugieren. 10.000 x g Bei diesem Schritt wird das restliche Ethanol entfernt. 8 Hochreine DNS eluieren Die hyplex Prep Säule in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß geben und 100 µl vorgewärmten Elutionspuffer BE (50 C) hinzufügen. Den Puffer direkt auf die Silika Membran pipettieren. bei Raumtemperatur inkubieren. bei 10.000 x g zentrifugieren. Alternative Elutionsverfahren: siehe Kapitel 2.5 + 100 µl BE (50 C) RT 10.000 x g

4.3 Reinigung genomischer DNS aus Trachealsekreten / Sputum 11 Vor dem Beginn der Präparation den Inkubator auf 99 C erwärmen. Puffer BE bei 50 C equilibrieren. Puffer B3 und B5 vorbereiten (siehe Kapitel 3). 1 Vorbehandlung: 100 µl des Trachealsekrets oder Sputums in ein 2,0 ml Reaktionsgefäße mit Schraubdeckel geben und 50 µl ACC (N-Acetylcystein)-Lösung (Best.-Nr. 3952) hinzufügen. Gut durchmischen und bei 37-50 C für 30 min inkubieren (bei Bedarf auch ü.n. möglich). 250 µl hyplex Lyse-Puffer (Best.-Nr. 3950) zugeben und gründlich mischen. 2 Proben lysieren Proben bei 99 C für 10 min inkubieren. 100 µl Probe + 50 µl ACC 37 C; 30 min + 250 µl hyplex Lyse- Puffer 99 C; 10 min 3 Separation der Zellreste 2 min bei 10.000 x g abzentrifugieren und vom Überstand 200 µl in ein neues steriles Reaktionsgefäß pipettieren (Empfohlen werden 1,5 ml Reaktionsgefäße). 2min 200 µl Überstand 4 Einstellen der Bedingungen für die DNS Bindung 200 µl Puffer B3 zu jeder Probe hinzufügen und gut durchmischen. 210 µl Ethanol p.a. (96-100 %) zu jeder Probe hinzufügen und gut durchmischen. 5 DNS Bindung Für jede Präparation eine hyplex Prep Säule, die sich in einem 2 ml Sammelbehälter befindet, verwenden und mit der Probe beladen bei 10.000 g zentrifugieren. Falls die Probe nicht vollständig durch die Matrix in den Sammelbehälter tritt, die Zentrifugation bei höherer Umdrehungszahl wiederholen (max. bis 12.000 g). Sammelbehälter mit Durchfluss verwerfen. +200 µl B3 mischen + 210 µl Ethanol mischen mit Lysat beladen 10.000 g

12 6 Silika Membran waschen 1. Wäsche Die hyplex Prep Säule in einen neuen 2 ml Sammelbehälter geben und 500 µl Puffer BW zugeben. bei 10.000 x g zentrifugieren. Durchfluss verwerfen. 2. Wäsche Die hyplex Prep Säule zurück in den Sammelbehälter stellen und 600 µl Puffer B5 hinzugeben. bei 10.000 x g zentrifugieren. Durchfluss verwerfen. + 500 µl BW 10.000 x g + 600 µl B5 10.000 x g 7 Silika Membran trocknen Die hyplex Prep Säule zurück in den Sammelbehälter stellen und bei 10.000 x g zentrifugieren. 10.000 x g Bei diesem Schritt wird das restliche Ethanol entfernt. 8 Hochreine DNS eluieren Die hyplex Prep Säule in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß geben und 100 µl vorgewärmten Elutionspuffer BE (50 C) hinzufügen. Den Puffer direkt auf die Silika Membran pipettieren. bei Raumtemperatur inkubieren. bei 10.000 x g zentrifugieren. Alternative Elutionsverfahren: siehe Kapitel 2.5 + 100 µl BE (50 C) RT 10.000 x g

13 5. Anhang 5.1 Troubleshooting Problem Mögliche Ursache und Lösungsvorschlag Unvollständige Zell-Lyse Mindestens 10 min bei 99 C (Thermoblock) inkubieren. Zu viel Zellmaterial kann die Lyse hemmen. Beim Einsatz von Trachealsekreten: Mehr ACC-Lösung (bis 100 µl) zur Probe hinzugeben und die Inkubation bei 37-50 C auf bis zu 1 Stunde verlängern; die Probe muss vor der Weiterbehandlung flüssig sein. Keine oder geringe DNS- Ausbeute Reagenzien nicht korrekt eingesetzt Puffer wie im Abschnitt 3 beschrieben herstellen. Ethanol zum Lysat geben, bevor die Prep Säule damit beladen wird. Suboptimale Elution der DNS von der Säule Vor der Elution Puffer BE auf 70 C erwärmen. Puffer BE direkt mittig auf die Silika Membran geben. Die Effizienz der Elution sinkt drastisch, wenn der Elutionspuffer einen ph < 7,0 aufweist. Verwendung eines leicht alkalischen Elutionspuffers, wie Puffer BE (ph 8,5). Schlechte Qualität der DNS Reagenzien nicht korrekt eingesetzt Puffer wie im Abschnitt 3 beschrieben herstellen. Ethanol zum Lysat geben, bevor die Prep Säule damit beladen wird. Fragmentierung der DNS Nicht länger als 10 min und nicht höher als 99 C (Thermoblock) inkubieren.

14 Suboptimale Performance der genomischen DNS in späteren Anwendungen Carryover von Ethanol Sicherstellen, dass der ethanolhaltige Puffer B5 vollständig entfernt wurde, bevor die DNS eluiert wird. Falls der Puffer B5 aus irgendeinem Grund den Säulenausgang erst nach dem zweiten Waschschritt erreicht hat, den Durchfluss verwerfen, die Säule wieder in das Sammelröhrchen stecken und erneut zentrifugieren. Kontamination der DNS mit inhibitorischen Substanzen Falls die DNA mit Tris/EDTA-Puffer (TE) eluiert wurde, kann die nachfolgende Anwendung beeinflußt werden; gegebenenfalls DNA erneut aufreinigen und im BE Puffer eluieren. Wiederholung der Aufreinigung, falls das A 260/280 -Verhältnis des Eluates kleiner als 1,6 ist: 1 Volumen des Puffers B3 plus 1 Volumen Ethanol zum Eluat geben, auf eine hyplex Prep Säule laden, und mit Schritt 3 des entsprechenden Protokolls fortfahren. 5.2 Bestellinformationen Produkt Best.-Nr. Packungsgröße hyplex Lyse-Puffer 3950 60 ml hyplex Prep Modul 3951 50 Präparationen ACC (N-Acetylcysteinlösung) 3952 10 ml Filtrationsfläschchen 3957 20 Fläschchen 5.3 Produktverwertbarkeits - Einschränkung / Garantie Die Komponenten des hyplex -Prep-Kits werden nur für Forschungszwecke produziert und verkauft. Es wird nicht der Anspruch erhoben oder mit der Aussage geworben, das Produkt würde sich für die Identifikation eines bestimmten Keims oder für die klinische Anwendung (im Bereich von Diagnostik, Prognose, Therapie oder Bluttransfusionswesen) eignen.

15 Vielmehr obliegt es dem Anwender, die Eignung des hyplex -Prep-Moduls für einen bestimmten Anwendungsbereich nachzuweisen, da die Leistungsmerkmale dieses Kits nicht für einen bestimmten Organismus verifiziert sind. Zusammen mit diesem Produkt wird eine Dokumentation ausgeliefert, in der Spezifikationen und andere technische Daten enthalten sind. BAG gewährleistet die Einhaltung der angegebenen Spezifikationen. Für den Fall, dass die gelieferten Produkte nicht den garantierten Spezifikationen entsprechen, beschränken sich die Verpflichtungen von BAG und die Ansprüche des Kunden allein auf den kostenlosen Ersatz der Produkte. Ansonsten wird auf die Allgemeinen Geschäftsbedingungen von BAG verwiesen. Auf Wunsch werden wir Ihnen unsere Allgemeinen Geschäftsbedingungen gerne zukommen lassen. BAG übernimmt keinerlei sonstige Garantie. Zurückgewiesen und ausgeschlossen werden INSBESONDERE ALLE ANDEREN, GLEICH OB DIREKT ODER INDIREKT, AUS- DRÜCKLICH ODER IMPLIZIT GEWÄHRTEN GARANTIEN JEDWEDER ART UND NATUR, EINSCHLIESSLICH, ABER NICHT BESCHRÄNKT AUF GARANTIEN HIN- SICHTLICH DER EIGNUNG, REPRODUZIERBARKEIT, LEBENSDAUER, ANWEND- BARKEIT FÜR EINEN BESTIMMTEN ZWECK ODER ANWENDUNGSBEREICH, MARKTFÄHIGKEIT, ZUSTAND ODER IRGENDEINEN SONSTIGEN ASPEKT DER BAG-PRODUKTE. BAG übernimmt auf keinen Fall die Haftung für irgendwelche sonstigen Schäden, gleich ob direkte oder mittelbare, kompensatorische, im Voraus absehbare spezielle, Nebenoder Folgeschäden (einschließlich, aber nicht beschränkt auf entgangene Nutzung sowie Verlust von Erträgen oder Gewinn), unabhängig davon, ob Ansprüche aufgrund von Garantien, Verträgen oder unerlaubten Handlungen (einschließlich Fahrlässigkeit) oder Haftungsansprüche im engeren Sinne, die sich aus dem Verkauf oder aus einer eventuellen Nichtkonformität von BAG-Produkten mit den angegebenen Spezifikationen ergeben, geltend gemacht werden. Diese Garantie kann nicht durch andere Vereinbarungen ersetzt oder ergänzt werden. BAG übernimmt keine anderen ausdrücklichen oder stillschweigenden Garantien.

16 Instructions for use hyplex Prep Module To isolate genomic DNA from swabs, blood cultures, serum, plasma or other body fluids 1. Kit contents 50 preps Cat. No. 3951 Buffer B1 10 ml Reagent B2 Buffer B5 (concentrate) Buffer BW Buffer BE 2.5 ml 7 ml 30 ml 13 ml hyplex Prep columns (plus collection tubes) 50 2 ml collection tubes Label for buffer B3 Instructions for use 50 1 1 For preparation of working solutions and storage conditions see section 3.

17 2. Product description 2.1 The basic principle With the hyplex Prep method, genomic DNA is prepared from swabs, blood cultures, cultured cells, serum, plasma or other body fluids. Lysis is achieved by incubation of the sample in a solution containing hyplex lysis buffer (Order No. 3950) at 99 C for 10 min. Appropriate conditions for binding of DNA to the silica membrane of the corresponding hyplex Prep columns are created by addition of a binding buffer and ethanol to the lysate. The binding process is reversible and specific to nucleic acids. Washing steps efficiently remove contaminations. 2.2 About this Instructions for use Experienced users who are performing the isolation of genomic DNA using a hyplex Prep isolation kit may refer to the Protocol-at-a-glance instead of this User Manual. The Protocol-at-a-glance is designed to be used only as a supplemental tool for quick referencing while performing the purification procedure. First-time users are strongly advised to read this User Manual. 2.3 Kit specifications hyplex Prep kits are designed for the rapid isolation of highly pure genomic DNA from swabs, blood cultures, serum, plasma, or other body fluids. It is also possible to purify viral DNA (e.g. HBV). As viral DNA co-purifies with cellular DNA, we recommend usage of cell-free sample (serum or plasma) to prepare pure viral DNA. The kits allow purification of highly pure genomic DNA with an A 260/280 -ratio between 1.60 and 1.90 in a typical concentration of 40 60 ng per µl. The obtained DNA is ready to use for subsequent reactions like PCR, Southern blotting, or any kind of enzymatic reactions.

18 2.4 Storage of samples For the isolation of genomic DNA from positive blood cultures using a hyplex Prep kit the samples can be stored at +4 C or -20 C. Blood culture samples stored at +4 C or -20 C for up to several days or weeks, respectively, will still allow DNA isolation. However, DNA yield and quality will slowly decrease due to prolonged storage of blood culture samples under these conditions. Highest yields and quality of DNA is obtained from fresh blood cultures! Other kinds of samples like urine, tracheal secretions, sputum or swabs should be stored at +4 C. However, DNA yield and quality will slowly decrease due to prolonged storage under these conditions, too. 2.5 Elution procedures It is possible to adapt elution method and volume of elution buffer to the subsequent application of interest. In addition to the standard method (recovery rate about 70 90 %) there are several modifications possible. Use elution buffer preheated to 50 C for one of the following procedures: High yield: Perform two elution steps with the volume indicated in the individual protocol. About 100 % of bound nucleic acid can be eluted. High concentration: Perform one elution step with 60 % of the volume indicated in the individual protocol. Concentration of DNA will be higher than with standard elution (ca. 130 %). Maximal yield of bound nucleic acid is about 80 %. High yield and high concentration: Apply half the volume of elution buffer as indicated in the individual protocol, incubate for 3 min and centrifuge. Apply a second aliquot of elution buffer, incubate and centrifuge again. Thus, about 85-100 % of bound nucleic acid is eluted in the standard elution volume at a high concentration. Convenient elution: For convenience, elution buffer of ambient temperature may be used. This will result in a somewhat lower yield (approximately 20 %) compared to elution with heated elution buffer. Elution may also be performed with Tris-EDTA-buffer (TE) of ph 8. This will increase DNA stability especially during long term and/or multi use storage at 4 C or ambient temperature by inhibition of omnipresent DNases. However, EDTA interferes, depending on the final concentration, with certain subsequent applications, especially PCR.

19 For optimal performance of isolated DNA in subsequent applications we recommend elution with the supplied elution buffer and storage, especially long term, at -20 C. Several freeze-thaw cycles will not interfere with most subsequent applications. 3. Storage conditions and preparation of working solutions Attention: Buffers B1, B3, and BW contain guanidine hydrochloride! Wear gloves and goggles! All kit components can be stored at room temperature (20...25 C) and are stable up to one year after date of production. Before starting any hyplex Prep protocol, prepare the following: Buffer B5: Add 28 ml ethanol p.a. (96-100 %) to buffer B5 concentrate resulting in 35 ml of ready-to-use buffer B5. Buffer B5 is storable at room temperature (20...25 C) for up to one year after date of production. Prepare buffer B3: Transfer buffer B1 to reagent B2 completely and mix well. The resulting buffer B3 is stable at room temperature for at least 12 months after date of production. Upon storage, especially at low temperatures, a white precipitate may form in buffer B3 or B1. Dissolve such precipitates by incubation of the bottle at 50 C before use.

4. Protocols for DNA purification with hyplex PrepModul 20 4.1 Genomic DNA purification of swabs / body fluids Before starting with the preparation, set incubator to 99 C. Equilibrate buffer BE to 50 C. Prepare buffer B3 and B5 (section 3). 1 Pre- treatment Swabs: Squeeze out the swabs vigorously in 200 µl hyplex lysis buffer (Best.-Nr. 3950) (2.0 ml micro centrifuge tubes with screw cap recommended). Body fluids: Centrifuge the fluid 10 min at 12.000 x g and discard supernatant. Resuspend pellet in 200 µl hyplex lysis buffer (2.0 ml micro centrifuge tubes with screw cap recommended). 200 µl hyplex lysis buffer Semen: Mix 100 µl Semen with 200 µl hyplex lysis buffer (2.0 ml micro centrifuge tubes with screw cap recommended). 2 Sample Lysis Incubate samples at 99 C for 10 min. 99 C; 10 min 3 Clearance of cell debris Centrifuge for 2 min at and transfer 200µl of the supernatant in a new sterile tube (1.5 ml micro centrifuge tube recommended). 2min 200 µl supernatant 4 Adjust DNA binding conditions Add 200 µl buffer B3 to each sample and mix well. Add 210 µl ethanol p.a. (96-100 %) to each sample and mix well again. + 200 µl B3 mix + 210 µl ethanol mix

21 5 DNA Binding For each preparation, take one hyplex Prep column placed in a 2 ml micro centrifuge tube and load the sample. Centrifuge at 10 000 g. If the samples are not drawn through the matrix completely, repeat the centrifugation at higher g-force (up to 12 000 g). Discard collecting tube with flow-through. load lysate 10 000 g 6 Wash silica membrane 1 st wash Place the hyplex Prep column into a new 2 ml collecting tube and add 500 µl buffer BW. Centrifuge at. Discard flow-through. 2 nd wash Place the hyplex Prep column back into the collecting tube and add 600 µl buffer B5. Centrifuge at. Discard flow-through + 500 µl BW + 600 µl B5 7 Dry silica membrane Place the hyplex Prep column back into the collecting tube and centrifuge at. Residual ethanol is removed during this step 8 Elute highly pure DNA Place the hyplex Prep column in a 1.5 ml micro centrifuge tube and add 100 µl prewarmed elution buffer BE (50 C). Dispense buffer directly onto the silica membrane. Incubate at room temperature for. Centrifuge at. For alternative elution procedures see section 2.5 + 100 µl BE (50 C) RT

22 4.2 Genomic DNA purification of blood cultures Before starting with the preparation, set incubator to 99 C. Equilibrate buffer BE to 50 C. Prepare buffer B3 and B5 (section 3). 1 Pre-treatment Bring 1-2 ml blood culture fluid into the filtration vials (Cat. Nr. 3957), shake it well and discharge the first 5 drops. Drop 1-2 ml into a sterile tube. Centrifuge for 2 min at 10. 000 x g and discard supernatant. Resuspend pellet in 200 µl hyplex lysis buffer. 2 Sample Lysis Incubate sample at 99 C for 10 min. 1-2 ml culture into the bottle mix discharge 5 drops 1-2 ml into tube pellet in 200 µl hyplex lysis buffer 99 C; 10 min 3 Clearance of cell debris Centrifuge for 2 min at and transfer 200µl of the supernatant in a new sterile tube (1.5 ml micro centrifuge tube recommended). 2min 200 µl supernatant 4 Adjust DNA binding conditions Add 200 µl buffer B3 to each sample and mix Add 210 µl ethanol p.a. (96-100 %) to each sample and mix again. + 200 µl B3 + 210 µl ethanol mix

23 5 DNA Binding For each preparation, take one hyplex Prep column placed in a 2 ml micro centrifuge tube and load the sample. Centrifuge at 10 000 g. If the samples are not drawn through the matrix completely, repeat the centrifugation at higher g-force (up to 12 000 g). Discard collecting tube with flow-through. load lysate 6 Wash silica membrane 1 st wash Place the hyplex Prep column into a new 2 ml collecting tube and add 500 µl buffer BW. Centrifuge at. Discard collecting tube with flow-through. 2 nd wash Place the hyplex Prep column back into the collecting tube and add 600 µl buffer B5. + 500 µl BW + 600 µl B5 Centrifuge at. Discard flow-through. 7 Dry silica membrane Place the hyplex Prep column back into the collecting tube and centrifuge at. Residual ethanol is removed during this step 8 Elute highly pure DNA Place the hyplex Prep column in a sterile 1.5 ml micro centrifuge tube and add 100 µl prewarmed elution buffer BE (50 C). Dispense buffer directly onto the silica membrane. Incubate at room temperature for. Centrifuge at. For alternative elution procedures see section 2.5 + 100 µl BE (50 C) RT

4.3 Genomic DNA purification of tracheal secretions / sputum 24 Before starting with the preparation, set incubator to 99 C. Equilibrate buffer BE to 50 C. Prepare buffer B3 and B5 (section 3). 1 Pre-treatment: Transfer 100 µl of tracheal secretion or sputum in a 2.0 ml micro centrifuge tubes with screw cap and add 50 µl of ACC (N-acetylcysteine) solution (Cat.-No. 3952). Mix well and incubate at 37-50 C for 30 min (or until it is liquid, if necessary over night). Add 250 µl hyplex lysis buffer (Cat.-No. 3950) and mix well. 2 Sample Lysis Incubate sample at 99 C for 10 min. 100 µl sample + 50 µl ACC 37 C; 30 min add 250 µl hyplex lysis buffer 99 C; 10 min 3 Clearance of cell debris Centrifuge at for 2 min and transfer 200 µl of supernatant in a new sterile tube (1.5 ml micro centrifuge tube recommended). 4 Adjust DNA binding conditions Add 200 µl buffer B3 to each sample and mix well. Add 210 µl ethanol p.a. (96-100 %) to each sample and mix again. 5 DNA Binding For each preparation, take one hyplex Prep column placed in a 2 ml micro centrifuge tube and load the sample. Centrifuge at. If the samples are not drawn through the matrix completely, repeat the centrifugation at higher g-force (up to 12 000 g). Discard collecting tube with flow-through. 2min 200µl supernatant + 200 µl B3 mix + 210 µl ethanol mix load lysate

25 6 Wash silica membrane 1 st wash Place the hyplex Prep column into a new 2 ml collecting tube and add 500 µl buffer BW. + 500 µl BW Centrifuge at. Discard flow-through. 2 nd wash Place the hyplex Prep column back into the collecting tube and add 600 µl buffer B5. + 600 µl B5 Centrifuge at. Discard flow-through 7 Dry silica membrane Place the hyplex Prep column back into the collecting tube and centrifuge at. Residual ethanol is removed during this step 8 Elute highly pure DNA Place the hyplex Prep column in a 1.5 ml micro centrifuge tube and add 100 µl prewarmed elution buffer BE (50 C). Dispense buffer directly onto the silica membrane. Incubate at room temperature for. Centrifuge at. For alternative elution procedures see section 2.5 + 100 µl BE (50 C) RT

26 5. Appendix 5.1 Troubleshooting Problem Possible cause and suggestions Incomplete cell lysis Incubate for at least 10 min at 99 C (thermoblock). Too much cell material can hinder the lysis procedure. In the case of tracheal secretions: Add more ACC solution (up to 100 µl) to the sample and prolong incubation at 37-50 C up to 1 hour; the sample has to be liquid before further processing. No or poor DNA yield Reagents not applied properly Prepare buffers according to instructions (section 3). Add ethanol to lysates before loading them on columns. Suboptimal elution of DNA from the column Preheat buffer BE to 70 C before elution. Apply BE directly onto the center of the silica membrane. Elution efficiencies decrease dramatically if elution is performed with buffers of ph < 7.0. Use slightly alkaline elution buffer like buffer BE (ph 8.5). Poor DNA quality Reagents not applied properly Prepare buffers according to instructions (section 3). Add ethanol to lysates and mix before loading them on columns. Fragmentation of DNA Incubate not longer than 10 min and not higher than 99 C (thermoblock).

27 Carryover of ethanol Be sure to remove all of ethanolic buffer B5 before eluting the DNA. If the level of B5 after the second wash has reached the column outlet for any reason, discard flow-through, place the column back into the collecting tube, and centrifuge again. Suboptimal performance of genomic DNA in subsequent applications Contamination of DNA with inhibitory substances If DNA has been eluted with Tris/EDTA-buffer (TE), make sure that ETDA does not interfere with subsequent applications or repurify DNA and elute in BE buffer. If the A 260/280 -ratio of the eluate is below 1.6, repeat the purification procedure: Add 1 volume of buffer B3 plus 1 volume ethanol to the eluate, load on hyplex Prep column, and proceed with step 3 of the corresponding protocol. 5.2 Ordering information Product Cat. No. Pack of hyplex lysis buffer 3950 60 ml hyplex Prep Module 3951 50 preps ACC (N-acetylcysteine solution) 3952 10 ml Filttration vials 3957 20 bottles 5.3 Product Use Restriction / Warranty hyplex Prep kits components are produced and sold for research purposes only. No claim or representation is intended for its use to identify any specific organism or for clinical use (diagnostic, prognostic, therapeutic or blood banking). It is rather the responsibility of the user to verify the use of the hyplex Prep kits for a specific application range as the performance characteristic of this kit has not been verified to a specific organism.

28 This product is shipped with documentation stating specifications and other technical information. BAG warrants to meet the stated specifications. BAG s sole obligation and the customer s sole remedy is limited to replacement of products free of charge in the event products fail to perform as warranted. Supplementary reference is made to the general business terms and conditions of BAG. Please contact us if you wish a copy. BAG makes no other warranty of any kind whatsoever, and SPECIFICALLY DIS- CLAIMS AND EXCLUDES ALL OTHER WARRANTIES OF ANY KIND OR NATURE WHATSOEVER, DIRECTLY OR INDIRECTLY, EXPRESS OR IMPLIED, INCLUDING, WITHOUT LIMITATION, AS TO THE SUITABILITY, REPRODUCTIVITY, DURABILITY, FITNESS FOR A PARTICULAR PURPOSE OR USE, MERCHANTABILITY, CONDI- TION, OR ANY OTHER MATTER WITH RESPECT TO BAG PRODUCTS. In no event shall BAG be liable for claims for any other damages, whether direct, indirect, incidental, compensatory, foreseeable, consequential, or special (including but not limited to loss of use, revenue or profit), whether based upon warranty, contract, tort (including negligence) or strict liability arising in connection with the sale or the failure of BAG products to perform in accordance with the stated specifications. This warranty is exclusive and BAG makes no other warranty expressed or implied.