peqgold Viral DNA/RNA Kit

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1 Arbeitsanleitung Instruction Manual peqgold Viral DNA/RNA Kit (Safety-Line) V0815

2 INHALT EINLEITUNG 1 FUNKTIONSPRINZIP 1 KITBESTANDTEILE 2 LAGERUNG 2 WICHTIGE HINWEISE 3 GEFÄHRLICHE INHALTSSTOFFE 4 A. PEQGOLD VIRAL DNA ISOLIERUNGSPROTOKOLL 6 B. PEQGOLD VIRAL RNA ISOLIERUNGSPROTOKOLL 8 QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER RNA 10 DNA-KONTAMINATIONEN 10 BESTELLINFORMATIONEN 11 TROUBLESHOOTING TIPS 12 CONTENT INTRODUCTION 13 THEORY 13 KIT COMPONENTS 14 STORAGE AND STABILITY 14 BEFORE STARTING 15 DANGEROUS COMPONENTS 16 A. PEQGOLD VIRAL DNA ISOLATION PROTOCOL 18 B. PEQGOLD VIRAL RNA ISOLATION PROTOCOL 20 QUANTITATION AND STORAGE OF RNA 22 DNA CONTAMINATION 22 ORDERING INFORMATION 23 TROUBLESHOOTING TIPS 24 APPENDIX 25

3 EINLEITUNG Der peqgold Viral DNA/RNA Kit bietet eine schnelle und einfache Methode um virale RNA aus unterschiedlichsten zellfreien Flüssigkeiten wie beispielsweise Serum, Plasma, Urin und Zellkulturüberstand zu isolieren. Unter anderem ist das System auch für die Isolierung von RNA der Hepatitis-A-, Hepatitis-C und HI-Viren geeignet. Ebenso kann auch virale DNA mithilfe des gleichen Protokolls und der gleichen Reagenzien isoliert werden. RNA und DNA, die mit dem peqgold Viral DNA/RNA Kit isoliert wurde, kann für alle Arten von Folge-experimenten, wie z. B. RT-PCRs, weiterverwendet werden. FUNKTIONSPRINZIP Der peqgold Viral DNA/RNA Kit kombiniert die selektiven und reversiblen Bindungseigenschaften von PerfectBind-Silikamembranen mit der Schnelligkeit und leichten Durchführbarkeit von Zentrifugationssäulenmethoden. Ein speziell entwickeltes und optimiertes Puffersystem erlaubt die Reinigung von bis zu 100 µg nicht-degradierter RNA mit Moleküllängen ab 200 Basen aufwärts. Unter denaturierenden Bedingungen wird zuerst eine Lyse durchgeführt, bei der alle vorhandenen RNasen und sonstigen Enzyme effizient inhibiert werden und die virale DNA/RNA vor Degradationen geschützt wird. Das Lysat wird anschließend auf eine PerfectBind RNA Column geladen, in der die RNA- oder DNA-Moleküle an die darin enthaltene Silikamembran binden. Nach zwei kurzen Waschschritten mit speziellen Puffern kann die gereinigte und qualitativ sehr hochwertige DNA/RNA abschließend in RNasefree Water eluiert werden. peqgold Viral DNA/RNA Art.-Nr.: PEQLAB_v0815D 1

4 KITBESTANDTEILE peqgold Viral DNA/RNA Kit 5 Reinigungen 50 Reinigungen 200 Reinigungen Bestellnummer Bestandteile PerfectBind RNA Columns ml Collection Tubes x 200 Extraction Tubes RNA Lysis Buffer T 2 x 1.5 ml 25 ml 100 ml RNA Binding Solution 3 ml 35 ml 140 ml RNA Wash Buffer I 5 ml 50 ml 200 ml RNA Wash Buffer II (Konz.) 2 ml 20 ml 3 x 20 ml RNase-free Water 1 ml 5 ml 20 ml Arbeitsanleitung LAGERUNG Die Aufbewahrung der Extraction Tubes sollte bei 4 C erfolgen. Alle anderen Bestandteile des peqgold Viral DNA/RNA Kits sollten bei Raumtemperatur gelagert werden. Bei einer Umgebungstemperatur von C bleiben diese Komponenten des Kits für mindestens 12 Monate ab Lieferung stabil. Kristalle, die sich während der Lieferung oder Lagerung im RNA Lysis Buffer T bilden, können durch Erwärmen auf 37 C wieder gelöst werden. peqgold Viral DNA/RNA Art.-Nr.: PEQLAB_v0815D 2

5 WICHTIGE HINWEISE Bitte lesen Sie das vorliegende Protokoll vor der ersten Verwendung des Kits vollständig durch und legen Sie vor Präparationsbeginn alle für die Isolierung benötigten Materialien bereit, um durch unnötige Zeitverzögerungen verursachte RNA-Degradationen zu vermeiden.! Bei allen Arbeiten mit RNA sollten zur Vermeidung von RNase-Kontaminationen Einmalhandschuhe getragen werden. Zum Pipettieren der im Kit enthaltenen Puffer sollten ausschließlich saubere, RNase-freie Einmalpipettenspitzen verwendet werden.! RNA-Präparationen sollten besonders sorgfältig, daneben aber auch so zügig wie möglich durchgeführt werden.! Bei niedrigen Außentemperaturen kann es im RNA Lysis Buffer T zur Bildung von Salzkristallen kommen. Diese Kristallbildung ist normal, sollte aber vor der Verwendung des Puffers durch Erwärmen auf 37 C rückgängig gemacht werden.! Das Protokoll wurde optimiert für 150 µl Probenmaterial. Bei Verwendung von geringeren Volumina, das Volumen mit PBS oder RNase freiem Wasser auf 150 µl bringen. Ist das Volumen größer als 150 µl muss das einzusetzende Volumen des RNA Lysis Buffer T entsprechend erhöht werden.! RNA Wash Buffer II wird als Konzentrat geliefert und muss vor seiner ersten Verwendung mit absolutem Ethanol verdünnt werden: Kit Kit Kit ml RNA Wash Buffer II mit 8 ml 100 % EtOH mischen. 20 ml RNA Wash Buffer II mit 80 ml 100 % EtOH mischen. 3 x 20 ml RNA Wash Buffer II mit 3 x 80 ml 100 % EtOH mischen.! Verdünnter RNA Wash Buffer II sollte bei Raumtemperatur gelagert oder vor seiner Verwendung auf Raumtemperatur gebracht werden.! Alle Arbeitsschritte bei Raumtemperatur durchführen. peqgold Viral DNA/RNA Art.-Nr.: PEQLAB_v0815D 3

6 GEFÄHRLICHE INHALTSSTOFFE peqgold Viral DNA/RNA Kit Bestandteile PerfectBind RNA Columns 2 ml Collection Tubes Extraction Tubes RNA Lysis Buffer T RNA Binding Solution RNA Wash Buffer I Signalwort / Symbole Gefährliche Inhaltsstoffe H- und P-Sätze DANGER guanidinium thiocyanate %, CAS: DANGER Guanidinthiocyanat %, CAS: DANGER guanidinium thiocyanate 25-50%, CAS: DANGER Ethanol 25-50%, guanidinium thiocyanate 10-<25%, CAS: , H302+H312+H332, H314, H412, P101, P102, P103, P260, P280, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 H302+H312+H332, H314, H412, P101, P102, P103, P260, P280, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 H302+H312+H332, H314, H412, P101, P102, P103, P260, P280, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 H225, H314, P101, P102, P103, P210, P241, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 RNA Wash Buffer II (Konz.) RNase-free Water peqgold Viral DNA/RNA Art.-Nr.: PEQLAB_v0815D 4

7 H- und P-Sätze Erläuterungen H225 Flüssigkeit und Dampf leicht entzündbar. H302+H312+H332 Gesundheitsschädlich bei Verschlucken, Hautkontakt oder Einatmen. H314 H412 P101 P102 P103 P210 P241 P260 P280 P303+P361+P353 P305+P351+P338 P405 P501 Verursacht schwere Verätzungen der Haut und schwere Augenschäden. Schädlich für Wasserorganismen, mit langfristiger Wirkung. Ist ärztlicher Rat erforderlich, Verpackung oder Kennzeichnungsetikett bereithalten. Darf nicht in die Hände von Kindern gelangen. Vor Gebrauch Kennzeichnungsetikett lesen. Von Hitze, heissen Oberflächen, Funken, offenen Flammen sowie anderen Zündquellenarten fernhalten. Nicht rauchen. Explosionsgeschützte elektrische Geräte/Lüftungsanlagen/ Beleuchtungsanlagen/... verwenden. Staub/Rauch/Gas/Nebel/Dampf/Aerosol nicht einatmen. Schutzhandschuhe/Schutzkleidung/Augenschutz/Gesichtsschutz tragen. BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT (oder dem Haar): Alle kontaminierten Kleidungsstücke sofort ausziehen. Haut mit Wasser abwaschen/duschen. BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser ausspülen. Eventuell vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter ausspülen. Unter Verschluss aufbewahren. Inhalt/Behälter zuführen. peqgold Viral DNA/RNA Art.-Nr.: PEQLAB_v0815D 5

8 A. PEQGOLD VIRAL DNA ISOLIERUNGSPROTOKOLL Mit dem peqgold Viral Kit kann neben viraler RNA auch Virus-DNA isoliert werden. Benötigte Materialien, die nicht mitgeliefert werden:! 100 % Ethanol! Sterile RNase-freie Pipettenspitzen und Zentrifugenröhrchen 1. Lyse 450 µl RNA Lysis Buffer T in ein Extraction Tube geben. Anschließend 150 µl Plasma, zellfreie Körperflüssigkeit, Zellkulturüberstand oder Urin zugeben, 10 Sekunden durch Vortexen sorgfältig mischen und für 15 Minuten bei RT inkubieren. 2. Laden und Binden 600 µl RNA Binding Solution zugeben und sorgfältig mittels einer Pipette mischen, bis eine homogene Lösung entsteht. PerfectBind RNA Column in ein Collection Tube stecken und 600 µl der Probe auf die PerfectBind RNA Column laden. Zentrifugation für 1 Minute bei x g*. Collection Tube verwerfen und PerfectBind RNA Column in ein neues Collection Tube stecken. Zugabe der restlichen 600 µl Probe und Zentrifugation für 1 Minute bei x g*. Collection Tube verwerfen und PerfectBind RNA Column in ein neues 2 ml Collection Tube stecken. Beachte: Sollte die Probe nicht vollständig durch den Filter gelaufen sein, dann die Zentrifugationszeit verlängern! 3. Waschen I 500 µl RNA Wash Buffer I auf die Säule pipettieren und für 1 Minute bei x g* durch die Säule zentrifugieren. Säulendurchfluss verwerfen und Collection Tube weiterverwenden. 4. Waschen II 650 µl des komplettierten RNA Wash Buffers II (Pufferkonzentrat plus 4 Volumen 100 % Ethanol) auf die PerfectBind RNA Column pipettieren. RNA Wash Buffer II für 1 Minute bei x g* durch die Säule zentrifugieren. Säulendurchfluss verwerfen und Collection Tube weiterverwenden. Waschschritt wiederholen. 5. Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!) PerfectBind RNA Column in das geleerte Collection Tube stecken und durch zweiminütiges Zentrifugieren bei x g* vollständig trocknen. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 25 peqgold Viral DNA/RNA Art.-Nr.: PEQLAB_v0815D 6

9 6. Elution PerfectBind RNA Column in ein sauberes 1.5 ml Zentrifugenröhrchen stecken und die DNA mit 30 bis 80 µl RNase-free Water eluieren. Dazu direkt auf die Matrix pipettieren, 2 Minuten inkubieren und 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Bei erwarteten DNA-Erträgen > 50 µg kann zur vollständigen Rückgewinnung der DNA eine zweite Elutionsrunde notwendig sein. Dabei ist zu berücksichtigen, dass zwar der absolute Ertrag verbessert wird, die DNA-Konzentration jedoch sinkt, da bereits bei der ersten Elution mehr als 80 % der gereinigten DNA zurückgewonnen werden. Ein Vorwärmen des RNase-free Water auf 70 C und eine der Zentrifugation vorangehende fünfminütige Inkubation der Säule können die Erträge noch weiter verbessern. Statt einer zweiten Elutionsrunde kann die DNA auch direkt in einem größeren Volumen RNase-free Water eluiert werden. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 25 peqgold Viral DNA/RNA Art.-Nr.: PEQLAB_v0815D 7

10 B. PEQGOLD VIRAL RNA ISOLIERUNGSPROTOKOLL Benötigte Materialien, die nicht mitgeliefert werden:! 100 % Ethanol! Sterile RNase-freie Pipettenspitzen und Zentrifugenröhrchen 1. Lyse 450 µl RNA Lysis Buffer T in ein Extraction Tube geben. Anschließend 150 µl Plasma, zellfreie Körperflüssigkeit, Zellkulturüberstand oder Urin zugeben, 10 Sekunden durch Vortexen sorgfältig mischen und für 15 Minuten bei RT inkubieren. 2. Laden und Binden 600 µl RNA Binding Solution zugeben und sorgfältig mittels einer Pipette mischen, bis eine homogene Lösung entsteht. PerfectBind RNA Column in ein Collection Tube stecken und 600 µl der Probe auf die PerfectBind RNA Column laden. Zentrifugation für 1 Minute bei x g*. Collection Tube verwerfen und PerfectBind RNA Column in ein neues Collection Tube stecken. Zugabe der restlichen 600 µl Probe und Zentrifugation für 1 Minute bei x g*. Collection Tube verwerfen und PerfectBind RNA Column in ein neues 2 ml Collection Tube stecken. Beachte: Sollte die Probe nicht vollständig durch den Filter gelaufen sein, dann die Zentrifugationszeit verlängern! 3. Waschen I 500 µl RNA Wash Buffer I auf die Säule pipettieren und für 1 Minute bei x g* durch die Säule zentrifugieren. Säulendurchfluss verwerfen und Collection Tube weiterverwenden. 4. DNase I Verdau (optional) Da durch die PerfectBind RNA-Technologie die vorhandene DNA größtenteils entfernt wird, ist ein zusätzlicher DNase-Verdau für die meisten Folgeanwendungen nicht erforderlich. Dennoch kann es bei einigen sensitiven RNA-Anwendungen nötig sein, die verbliebene DNA durch DNase-Behandlung zu entfernen. Das folgende Protokoll beschreibt den DNase I-Verdau direkt auf der PerfectBind RNA Column (Bestellnr.: /02). a. Für jede PerfectBind RNA Column folgenden DNase I Reaktionsmix vorbereiten: DNase I Digestion Buffer 73.5 µl RNase-freie DNase I (20 Kunitz units/µl) 1.5 µl Gesamtvolumen 75 µl peqgold Viral DNA/RNA Art.-Nr.: PEQLAB_v0815D 8

11 Hinweis: 1. DNase I ist sehr empfindlich gegenüber physikalischer Denaturierung, deshalb DNase I- Lösung niemals vortexen! Ein Invertieren des Tubes reicht zum Mischen aus. Den DNase I Reaktionsmix immer direkt vor der RNA-Isolation ansetzen. 2. Der DNase I Digestion Buffer ist im RNase-freien DNase I Digest Kit enthalten. Standard DNase Puffer sind nicht für den "on-membrane" Verdau geeignet! b. 75 µl des DNase I Reakionsmixes direkt auf die Membran der PerfectBind RNA Column pipettieren. Der DNase I Verdau kann nicht vollständig ablaufen, wenn ein Teil des Reaktionsmixes an der Wand oder dem O-Ring der Säule haftet. c. Säule bei Raumtemperatur (25-30 C) für 15 Minuten inkubieren. d. Säule in ein 2 ml Collection Tube stecken und 400 µl RNA Wash Buffer I zugeben. Säule bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubieren. Anschließend bei x g* für 5 Minuten zentrifugieren und Durchfluss verwerfen. Collection Tube im nächsten Schritt (Schritt 5) weiterverwenden. 5. Waschen II 650 µl des komplettierten RNA Wash Buffers II (Pufferkonzentrat plus 4 Volumen 100 % Ethanol) auf die PerfectBind RNA Column pipettieren. RNA Wash Buffer II für 1 Minute bei x g* durch die Säule zentrifugieren. Säulendurchfluss verwerfen und Collection Tube weiterverwenden. Waschschritt wiederholen. 6. Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!) PerfectBind RNA Column in das geleerte Collection Tube stecken und durch zweiminütiges Zentrifugieren bei x g* vollständig trocknen. 7. Elution PerfectBind RNA Column in ein sauberes 1.5 ml Zentrifugenröhrchen stecken und die RNA mit 30 bis 80 µl RNase-free Water eluieren. Dazu direkt auf die Matrix pipettieren, 2 Minuten inkubieren und 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Bei erwarteten RNA-Erträgen > 50 µg kann zur vollständigen Rückgewinnung der RNA eine zweite Elutionsrunde notwendig sein. Dabei ist zu berücksichtigen, dass zwar der absolute Ertrag verbessert wird, die RNA-Konzentration jedoch sinkt, da bereits bei der ersten Elution mehr als 80 % der gereinigten RNA zurückgewonnen werden. Ein Vorwärmen des RNase-free Water auf 70 C und eine der Zentrifugation vorangehende fünfminütige Inkubation der Säule können die Erträge noch weiter verbessern. Statt einer zweiten Elutionsrunde kann die RNA auch direkt in einem größeren Volumen RNase-free Water eluiert werden. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 25 peqgold Viral DNA/RNA Art.-Nr.: PEQLAB_v0815D 9

12 QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER RNA Die Größenverteilung der gereinigten Virus-RNA kann durch eine denaturierende Agarose- Gelelektrophorese (z.b. 1.2 % Agarose, 2.2 M Formaldehyd) und Hybridisierung mit einer virusspezifischen, markierten Sonde und anschließender Autoradiographie ermittelt werden. Zudem ist es empfehlenswert, die RNA-Ausbeute durch eine quantitative PCR zu bestimmen. RNA, die mit dem peqgold Viral RNA Kit aufgereinigt wurde, kann in RNase-free Water für mindestens ein Jahr bei -70 C aufbewahrt werden. DNA-KONTAMINATIONEN Mit keinem der aktuell verfügbaren RNA-Extraktionssysteme ist es möglich, genomische DNA vollständig zu entfernen. Für sensitive Experimente wie Differential Display oder RT- PCRs muss deshalb ein DNase I Verdau durchgeführt werden. Eine einfache und zeitsparende Möglichkeit bietet der DNase-Verdau direkt auf der Säule, der in das bestehende Protokoll integriert werden kann (s. Punkt 4: DNase I Verdau). Alternativ kann auch eine Nachbehandlung der isolierten RNA mit RNase-freier DNase durchgeführt werden. Der Nachweis des Vorhandenseins oder Fehlens von DNA-Kontaminationen kann mit Hilfe von intronüberspannenden Primern erfolgen, wobei das Entstehen von Banden Rückschlüsse auf mögliche Kontaminationen zulässt. peqgold Viral DNA/RNA Art.-Nr.: PEQLAB_v0815D 10

13 BESTELLINFORMATIONEN für die RNA-Isolierung aus Zellen, Geweben und Blut: peqgold Plant RNA Kit Reinigungen (Safety-Line) Reinigungen Reinigungen peqgold Bacterial RNA Kit Reinigungen (Safety-Line) Reinigungen Reinigungen peqgold Viral RNA Kit Reinigungen (Safety-Line) Reinigungen Reinigungen peqgold Total RNA Kit Reinigungen (Safety-Line) Reinigungen Reinigungen peqgold Total RNA Kit Reinigungen (Classic-Line) Reinigungen Reinigungen peqgold Blood RNA Kit Reinigungen (Safety-Line) Reinigungen Reinigungen peqgold Blood RNA Kit Reinigungen (Classic-Line) Reinigungen Reinigungen peqgold MicroSpin Total RNA Kit (Safety-Line) Reinigungen Reinigungen Reinigungen peqgold Viral DNA/RNA Art.-Nr.: PEQLAB_v0815D 11

14 TROUBLESHOOTING TIPS Problem Ursache Abhilfe Wenig oder keine RNA/DNA im Eluat RNA/DNA bleibt auf der Säule Säule ist überladen Elution wiederholen. RNase-free Water vor dem Eluieren auf 70 C erwärmen. Säule vor dem Eluieren für 10 min mit RNase-free Water inkubieren. Säule durch längere oder höhertourige Zentrifugation besser trocknen. Menge des Ausgangsmaterials reduzieren. Säule verstopft Unvollständige Lyse Nach Zugabe von RNA Lysis Buffer T gut mischen. Menge des Ausgangsmaterials reduzieren. RNA-Degradation Ausgangsmaterial Ausschließlich frisches Material verwenden, Proben nicht wiederholt auftauen und einfrieren Präparation zügiger und exakter nach Vorschrift durchführen. Probleme bei Folgereaktionen DNA-Kontamination RNase-Kontamination Salzübertragung während der Elution Physikalische Ähnlichkeit von DNA und RNA Nur RNase-freies Material verwenden und Handschuhe tragen. Puffer auf RNase-Kontaminationen überprüfen. Sicherstellen, dass RNA Wash Buffer II mit 4 Volumen 100 % EtOH verdünnt wurde. Sicherstellen, dass RNA Wash Buffer II bei Raumtemperatur gelagert und verwendet wurde. Waschschritt mit RNA Wash Buffer II wiederholen. Verdau mit RNase-freier DNase. (5 min bei 37 C inkubieren.) peqgold Viral DNA/RNA Art.-Nr.: PEQLAB_v0815D 12

15 INTRODUCTION peqgold Viral DNA/RNA Kits are designed for the quick and easy isolation of viral RNA from cell free fluids such as plasma, serum, urine and cell culture supernatants. This kit has been tested for isolating viral nucleic acids from hepatitis A, C and HIV. Furthermore viral DNA can be isolated using the same protocols and reagents. DNA/RNA purified using the peqgold Viral RNA method is ready for downstream applications such as RT-PCR etc. THEORY The peqgold Viral RNA Kits use reversible binding properties of PerfectBind matrix, a new silica-based, time saving spin technology material. Combined with the speed of minicolumn spin technology or vacuum manifold, multiple samples can be processed at the same time. The sample is first lysed under highly denaturing buffer conditions so that DNases/RNases will be inactivated and the intact viral DNA/RNA is protected from degrading. After adjusting the buffer condition, the samples are loaded to the PerfectBind RNA Column. With a brief centrifugation, the samples pass through the column and the viral DNA/RNA binds to the PerfectBind matrix. After two washing steps, purified viral nucleic acid will be eluted with RNase-free Water. peqgold Viral DNA/RNA Cat. No PEQLAB_v0815_E 13

16 KIT COMPONENTS peqgold Viral DNA/RNA Kit 5 Purifications 50 Purifications 200 Purifications Product Number Components PerfectBind RNA Columns ml Collection Tubes x 200 Extraction Tubes RNA Lysis Buffer T 2 x 1.5 ml 25 ml 100 ml RNA Binding Solution 3 ml 35 ml 140 ml RNA Wash Buffer I 5 ml 50 ml 200 ml RNA Wash Buffer II (conc.) 2 ml 20 ml 3 x 20 ml RNase-free Water 1 ml 5 ml 20 ml Instruction manual STORAGE AND STABILITY Extraction Tubes should be stored at 4 C. All other components of peqgold Viral DNA/RNA Kit should be stored at room temperature (22 C 25 C). All components are stable for at least 12 months from the date of purchase when stored at C. During shipment crystals may form in the RNA Lysis Buffer T. Warm up to 37 C to dissolve. peqgold Viral DNA/RNA Cat. No PEQLAB_v0815_E 14

17 BEFORE STARTING Briefly examine this booklet and become familiar with each step. Prepare all components and have the necessary materials ready before starting.! Whenever working with RNA, always wear latex gloves to minimize RNase contamination. Use only clean RNase-free disposable plastic pipette tips when using the supplied reagents.! Work carefully but as quickly as possible during the procedure.! Under cool ambient conditions, crystals may form in the RNA Lysis Buffer T. This is normal and the bottle should be warmed (37 C) to dissolve the salt before use.! Sample volume: The protocol is optimized for use with 150 µl samples. Smaller samples should be adjusted to 150 µl with PBS or RNase-free Water; lower titer samples should be concentrated to 150 µl before processing. For samples larger than 150 µl, the amount of RNA Lysis Buffer T and other reagents added to the sample before loading must be increased proportionally.! RNA Wash Buffer II is concentrated and has to be diluted with absolute ethanol as follows: Kit Kit Kit Add 8 ml 100 % EtOH to 2 ml RNA Wash Buffer II Add 80 ml 100 % EtOH to 20 ml RNA Wash Buffer II Add 3 x 80 ml 100 % EtOH to 3 x 20 ml RNA Wash Buffer II! Store diluted RNA Wash Buffer II at room temperature or equilibrate to room temperature before using.! All steps must be carried out at room temperature. peqgold Viral DNA/RNA Cat. No PEQLAB_v0815_E 15

18 DANGEROUS COMPONENTS peqgold Viral DNA/RNA Kit Components PerfectBind RNA Columns 2 ml Collection Tubes Extraction Tubes RNA Lysis Buffer T RNA Binding Solution RNA Wash Buffer I Signal word / symbols Dangerous components H and P statements DANGER guanidinium thiocyanate %, CAS: DANGER Guanidinthiocyanat %, CAS: DANGER guanidinium thiocyanate 25-50%, CAS: DANGER Ethanol 25-50%, guanidinium thiocyanate 10-<25%, CAS: , H302+H312+H332, H314, H412, P101, P102, P103, P260, P280, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 H302+H312+H332, H314, H412, P101, P102, P103, P260, P280, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 H302+H312+H332, H314, H412, P101, P102, P103, P260, P280, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 H225, H314, P101, P102, P103, P210, P241, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 RNA Wash Buffer II (Konz.) RNase-free Water peqgold Viral DNA/RNA Cat. No PEQLAB_v0815_E 16

19 H and P statements H225 H302+H312+H332 H314 H412 P101 P102 P103 P210 P241 P260 P280 P303+P361+P353 P305+P351+P338 P405 P501 Descriptions Highly flammable liquid and vapour. Harmful if swallowed, in contact with skin or if inhaled. Causes severe skin burns and eye damage. Harmful to aquatic life with long lasting effects. If medical advice is needed, have product container or label at hand. Keep out of reach of children. Read label before use. Keep away from heat, hot surfaces, sparks, open flames and other ignition sources. No smoking. Use explosion-proof electrical/ventilating/lighting/ / equipment. Do not breathe dust/fume/gas/mist/vapours/spray. Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face protection. IF ON SKIN (or hair): Take off immediately all contaminated clothing. Rinse skin with water/shower. IF IN EYES: Rinse cautiously with water for several minuts. Remove contact lenses, if present and easy to do. Continue rinsing. Store locked up. Dispose of contents/container to peqgold Viral DNA/RNA Cat. No PEQLAB_v0815_E 17

20 A. PEQGOLD VIRAL DNA ISOLATION PROTOCOL The peqgold Viral Kit can be used for the isolation of viral DNA. Materials required, but not supplied:! 100 % ethanol! Sterile RNase-free pipette tips and microcentrifuge tubes 1. Lysis Add 450 µl RNA Lysis Buffer T to an Extraction Tube. Pipet 150 µl plasma, cell free body fluid, cell culture supernatant or urine into the tube, mix thoroughly by vortexing for 10 seconds and incubate for 15 minutes at room temperature. 2. Load and bind Add 600 µl RNA Binding Solution and mix thoroughly by pipetting until a homogeneous solution is formed. Apply 600 µl of the sample to a PerfectBind RNA Column assembled in a 2 ml Collection Tube. Centrifuge for 1 minute at x g*. Discard Collection Tube and assemble PerfectBind RNA Column to a new Collection Tube. Apply residual 600 µl of the sample and centrifuge for 1 minute at x g*. Discard Collection Tube and assemble PerfectBind RNA Column to a new Collection Tube. Note: If the sample should not have passed through the filter completely, centrifugation time might need to be extended! 3. Wash I Add 500 µl RNA Wash Buffer I to the column and centrifuge the PerfectBind RNA Column/Collection Tube assembly for 1 minute at x g*. Discard flow-throw liquid and re-use the Collection Tube. 4. Wash II Add 650 µl completed RNA Wash Buffer II to the column and centrifuge the PerfectBind RNA Column/Collection Tube assembly for 1 minute at x g*. Discard the flowthrough liquid. Repeat this wash step using the same Collection Tube and discard the flow-through liquid. 5. Dry (Important, do not skip this step!) Place the PerfectBind RNA Column in the Collection Tube and centrifuge for 2 minutes at x g* to dry the column matrix. * Translation g (rcf) / rpm see Appendix, page 25 peqgold Viral DNA/RNA Cat. No PEQLAB_v0815_E 18

21 6. Elution Place the PerfectBind RNA Column into a fresh 1.5 ml microcentrifuge tube. Add µl RNase-free Water directly to the binding matrix in the PerfectBind RNA Column, incubate 2 minutes and centrifuge for 1 minute at x g* to elute DNA. A second elution may be necessary if the expected yield of DNA is > 50 µg. Alternatively, DNA may be eluted with a higher volume of water. While additional elution increase total DNA yield, the concentration will be lowered since more than 80 % of DNA is recovered with the first elution. Pre-heating RNase-free Water to 70 C before adding to the spin column and incubating the spin column for 5 minutes at room temperature before centrifugation may increase yield. Instead of eluting twice, the DNA can directly be eluted in a bigger volume of RNase-free Water. * Translation g (rcf) / rpm see Appendix, page 25 peqgold Viral DNA/RNA Cat. No PEQLAB_v0815_E 19

22 B. PEQGOLD VIRAL RNA ISOLATION PROTOCOL Materials required, but not supplied:! 100 % ethanol! Sterile RNase-free pipette tips and microcentrifuge tubes 1. Lysis Add 450 µl RNA Lysis Buffer T to an Extraction Tube. Pipet 150 µl plasma, cell free body fluid, cell culture supernatant or urine into the tube, mix thoroughly by vortexing for 10 seconds and incubate for 15 minutes at room temperature. 2. Load and bind Add 600 µl RNA Binding Solution and mix thoroughly by pipetting until a homogeneous solution is formed. Apply 600 µl of the sample to a PerfectBind RNA Column assembled in a 2 ml Collection Tube. Centrifuge for 1 minute at x g*. Discard Collection Tube and assemble PerfectBind RNA Column to a new Collection Tube. Apply residual 600 µl of the sample and centrifuge for 1 minute at x g*. Discard Collection Tube and assemble PerfectBind RNA Column to a new Collection Tube. Note: If the sample should not have passed through the filter completely, centrifugation time might need to be extended! 3. Wash I Add 500 µl RNA Wash Buffer I to the column and centrifuge the PerfectBind RNA Column/Collection Tube assembly for 1 minute at x g*. Discard flow-throw liquid and re-use the Collection Tube. 4. DNase I Digestion (optional) Since PerfectBind RNA resin and spin-column technology actually removes most of DNA without the DNase treatment, it is not necessary to do DNase digestion for most downstream applications. However, certain sensitive RNA applications might require further DNA removal. Following steps provide on-membrane DNase I digestion (Order No ). a. For each PerfectBind RNA Column, prepare this DNase I digestion reaction mix: DNase I Digestion Buffer 73.5 µl RNase-free DNase I (20 Kunitz units/µl) 1.5 µl Total volume 75 µl peqgold Viral DNA/RNA Cat. No PEQLAB_v0815_E 20

23 Note: 1. DNase I is very sensitive for physical denaturation, so do not vortex this DNase I mixture! Mix gently by inverting the tube. Prepare the fresh DNase I digestion mixture directly before RNA isolation. 2. DNase I Digestion Buffer is supplied with RNase-free DNase set. Standard DNase buffers are not compatible with on-membrane DNase digestion! b. Pipet 75 µl of the DNase I digestion reaction mix directly onto the surface of PerfectBind RNA resin in each column. Make sure to pipet the DNase I digestion mixture directly onto the membrane. DNase I digestion will not be complete if some of the mix stick to the wall or the O-ring of the PerfectBind RNA Column. c. Incubate at room temperature (25-30 C) for 15 minutes. d. Place a PerfectBind RNA Column into a new 2 ml Collection Tube and add 400 µl RNA Wash Buffer I. Place the column at benchtop for 5 minutes. Centrifuge at x g* for 5 minutes and discard flow-through. Re-use Collection Tube in the next step. Continue with step Wash II Add 650 µl completed RNA Wash Buffer II to the column and centrifuge the PerfectBind RNA Column/Collection Tube assembly for 1 minute at x g*. Discard the flowthrough liquid. Repeat this wash step using the same Collection Tube and discard the flow-through liquid. 6. Dry (Important, do not skip this step!) Place the PerfectBind RNA Column in the Collection Tube and centrifuge for 2 minutes at x g* to dry the column matrix. 7. Elution Place the PerfectBind RNA Column into a fresh 1.5 ml microcentrifuge tube. Add µl RNase-free Water directly to the binding matrix in the PerfectBind RNA Column, incubate 2 minutes and centrifuge for 1 minute at x g* to elute RNA. A second elution may be necessary if the expected yield of RNA is > 50 µg. Alternatively, RNA may be eluted with a higher volume of water. While additional elution increase total RNA yield, the concentration will be lowered since more than 80 % of RNA is recovered with the first elution. Pre-heating RNase-free Water to 70 C before adding to the spin column and incubating the spin column for 5 minutes at room temperature before centrifugation may increase yield. Instead of eluting twice, the RNA can directly be eluted in a bigger volume of RNase-free Water. * Translation g (rcf) / rpm see Appendix, page 25 peqgold Viral DNA/RNA Cat. No PEQLAB_v0815_E 21

24 QUANTITATION AND STORAGE OF RNA The size distribution of the purified virus RNA can be determined by a denaturing agarose gelelectrophoresis (e.g. 1.2 % agarose, 2.2 M formaldehyde) and hybridizing with a virus-specific, marked probe and following autoradiography. Besides it is recommendable to determine the RNA yield by a quantitative PCR. Store RNA samples at -70 o C in RNase-free Water. Under such conditions RNA prepared with the peqgold system is stable for at least one year. DNA CONTAMINATION No RNA extraction procedure can completely remove genomic DNA. For sensitive work (such as RT-PCR or differential display) we suggest that you treat the eluted RNA with RNase-free DNase. On-membrane DNase I Digestion (order no /02) is a simple and fast method and can be integrated into the standard protocol (see point 4). Alternatively, eluted RNA can be treated with RNase-free DNase. Also for RT-PCR, use intron-spanning primers that allow easy identification of DNAcontamination. Using RNA as a template in a control PCR reaction will also allow the detection of DNA contamination. peqgold Viral DNA/RNA Cat. No PEQLAB_v0815_E 22

25 ORDERING INFORMATION For RNA isolation from cells, tissues and blood: peqgold Plant RNA Kit Preparations (Safety-Line) Preparations Preparations peqgold Bacterial RNA Kit Preparations (Safety-Line) Preparations Preparations peqgold Viral RNA Kit Preparations (Safety-Line) Preparations Preparations peqgold Total RNA Kit Preparations (Safety-Line) Preparations Preparations peqgold Total RNA Kit Preparations (Classic-Line) Preparations Preparations peqgold Blood RNA Kit Preparations (Safety-Line) Preparations Preparations peqgold Blood RNA Kit Preparations (Classic-Line) Preparations Preparations peqgold MicroSpin Total RNA Kit Preparations (Safety-Line) Preparations Preparations peqgold Viral DNA/RNA Cat. No PEQLAB_v0815_E 23

26 TROUBLESHOOTING TIPS Problem Likely cause Suggestion Little or no DNA/RNA eluted Clogged column Degraded RNA Problem in downstream applications DNA contamination DNA/RNA remains on the column Column is overloaded Incomplete lysis Source RNase contamination Salt carry-over during elution Repeat elution. Pre-heat RNase-free Water to 70 o C prior to elution. Incubate column for 5 min with water prior to centrifugation. Increase centrifugation time or speed to completely dry the column. Reduce quantity of starting material. Mix thoroughly after addition of RNA Lysis Buffer T. Reduce amount of starting material. Do not freeze and thaw samples more than once, use only fresh samples. Follow protocol closely, and work quickly. Ensure not to introduce RNase during the procedure, use gloves. Check buffers for RNase contamination. Ensure RNA Wash Buffer II has been diluted with 4 volumes of 100 % ethanol. Diluted RNA Wash Buffer II must be stored at room temperature. Repeat wash step with RNA Wash Buffer II. Digest with RNase-free DNase and incubate at 37 C for 5 min. peqgold Viral DNA/RNA Cat. No PEQLAB_v0815_E 24

27 APPENDIX Abb. 1: Umrechnungstabelle rcf/rpm Werte für Zentrifugen, abhängig vom Rotordurchmesser Fig. 1: Table rcf/rpm values for centrifuges depending on rotor diameter peqgold Viral DNA/RNA Cat. No PEQLAB_v

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