peqgold Bacterial DNA Mini Kit

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1 Arbeitsanleitung Instruction Manual peqgold Bacterial DNA Mini Kit (Safety-Line) V0815

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3 INHALT EINLEITUNG 1 FUNKTIONSPRINZIP 1 KIT BESTANDTEILE 2 LAGERUNG 2 BINDEKAPAZITÄT 2 WICHTIGE HINWEISE 3 GEFÄHRLICHE INHALTSSTOFFE 4 PEQGOLD BACTERIAL DNA ISOLIERUNGSPROTOKOLLE 6 A. DNA-Isolation aus Bakterienpellets (gram - und gram + Bakterien) und Lyse mittels Lysozym 6 B. DNA-Isolation aus schwer aufschließbaren Bakterien, z.b. Mycobakterien (alternative Varianten) 8 AUFKONZENTRIERUNG DER DNA 10 QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER DNA 10 BESTELLINFORMATIONEN 11 TROUBLESHOOTING TIPS 12 CONTENT INTRODUCTION 14 THEORY 14 KIT COMPONENTS 15 STORAGE AND STABILITY 15 BINDING CAPACITY 15 BEFORE STARTING 16 DANGEROUS COMPONENTS 17 PEQGOLD BACTERIAL DNA ISOLATION PROTOCOL 19 A. DNA-Isolation from bacterial pellets (gram - und gram + bacteria) and lysis with lysozyme 19 B. DNA-Isolation from hardly lysable bacteria, e.g. mycobacteria (alternative variants) 21 CONCENTRATING THE DNA 23 QUANTITATION AND STORAGE OF DNA 23 ORDERING INFORMATION 24 TROUBLESHOOTING TIPS 25 APPENDIX 27

4 EINLEITUNG Der peqgold Bacterial DNA Kit bietet eine schnelle und einfache Methode, um hochwertige Gesamtzell-DNA (Bakteriengenom und Plasmide) aus bis zu 1 x 10 9 Zellen unterschiedlichster Bakterienspezies zu isolieren. In weniger als 2 Stunden gestattet er die Bearbeitung einzelner oder zahlreicher Proben, wobei jeweils bis zu 30 µg DNA isoliert werden können. Arbeitsaufwendige Extraktionen mit organischen Lösungsmitteln, wie Phenol oder Chloroform, müssen ebenso wenig durchgeführt werden, wie Fällungen mit Isopropanol oder Ethanol oder zeitaufwendige CsCl-Dichtegradientenzentrifugationen. Enzyminhibitoren und sonstige Kontaminationen werden vollständig entfernt. Gesamtzell-DNA, die mit dem peqgold Bacterial DNA Kit isoliert wurde, kann für alle Arten von Folgeexperimenten, wie PCR, RFLP-Analysen oder Southern Blotting weiterverwendet werden. FUNKTIONSPRINZIP Der peqgold Bacterial DNA Kit kombiniert die selektiven und reversiblen Bindungseigenschaften von PerfectBind Silikamembranen mit der Schnelligkeit und leichten Durchführbarkeit von Zentrifugationssäulenmethoden. Ein speziell entwickeltes und optimiertes Puffersystem erlaubt die Reinigung von bis zu 30 µg DNA mit Moleküllängen bis 60 kbp. Zellen von gram + - oder gram - Bakterienspezies werden bis zur log-phase kultiviert und geerntet. Nach dem Abbau der Zellwand mit Lysozym werden die Zellen durch einen Verdau mit Proteinase K lysiert. Das Lysat wird auf eine PerfectBind DNA Column geladen, in der die DNA-Moleküle an die darin enthaltene Silikamembran binden. Zellulärer Debris, Salze und andere Kontaminationen können durch zwei kurze Waschschritte mit speziellen Puffern schnell und effizient entfernt werden. Die gereinigte und qualitativ sehr hochwertige DNA wird abschließend in Elution Buffer oder sterilem, deionisierten Wasser eluiert. peqgold Bacterial DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 1

5 KIT BESTANDTEILE peqgold Bacterial DNA Kits 5 Reinigungen 50 Reinigungen 200 Reinigungen Bestellnummer Bestandteile PerfectBind DNA Columns ml Collection Tubes DNA Lysis Buffer T 2 ml 24 ml 90 ml DNA Binding Buffer 1.5 ml 12 ml 45 ml DNA Wash Buffer (Konz.) 4 ml 40 ml 3 x 40 ml (konz.) Elution Buffer 2 x 1.5 ml 25 ml 60 ml 10 mm TE Buffer 2 ml 20 ml 80 ml RNase A (20 mg/ml) 80 µl 800 µl 2 x 1.6 ml Lysozym 5 mg 50 mg 200 mg Proteinase K 3 mg 30 mg 120 mg Arbeitsanleitung LAGERUNG Bitte lagern Sie ungelöste Proteinase K und Lysozym kühl und trocken bei 4 C oder 20 C. Gelöste Proteinase K sowie Lysozym sollte aliquotiert und bei 20 C gelagert werden. Die Aufbewahrung von RNase A sollte bei 4 C erfolgen, alle anderen Kitkomponenten sind bei Raumtemperatur (20 bis 25 C) aufzubewahren und bleiben so für mindestens 12 Monate ab Lieferung stabil. Kristalle, die sich während der Lieferung oder Lagerung im DNA Binding Buffer bilden, können durch Erwärmen auf 37 C wieder gelöst werden. BINDEKAPAZITÄT Die Bindekapazität der PerfectBind DNA Column beträgt rund 30 µg DNA. Es sollten nicht mehr als die angegebenen Mengen an Ausgangsmaterial eingesetzt werden. peqgold Bacterial DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 2

6 WICHTIGE HINWEISE Bitte lesen Sie das vorliegende Protokoll vor der ersten Verwendung des Kits vollständig durch und legen Sie vor Präparationsbeginn alle für die Isolierung benötigten Materialien bereit.! DNA Binding Buffer enthält ein chaotropes Salz. Bei seiner Verwendung sollten deshalb Handschuhe und eine Schutzbrille getragen werden.! Bei niedrigen Außentemperaturen kann es im DNA Binding Buffer zur Bildung von Salzkristallen kommen. Diese Kristallbildung ist normal, sollte aber vor der Verwendung des Puffers durch Erwärmen auf 37 C rückgängig gemacht werden.! DNA Wash Buffer wird als Konzentrat geliefert und muss vor seiner ersten Verwendung mit absolutem Ethanol verdünnt werden: Kit Kit Kit ml DNA Wash Buffer mit 6 ml 100 % EtOH mischen. 40 ml DNA Wash Buffer mit 60 ml 100 % EtOH mischen. 3 x 40 ml DNA Wash Buffer mit 3 x 60 ml 100 % EtOH mischen.! Proteinase K wird als Pulver geliefert und muss vor ihrer ersten Verwendung durch Vortexen in TE Buffer gelöst werden: Kit Kit Kit mg Proteinase K in 150 µl TE Buffer lösen. 30 mg Proteinase K in 1.5 ml TE Buffer lösen. 120 mg Proteinase K in 6 ml TE Buffer lösen. Gelöste Proteinase K sollte aliquotiert bei 20 C gelagert und bei Bedarf frisch aufgetaut werden.! Lysozym Stammlösung (10 mg/ml) mit TE-Buffer ansetzen. Kit Kit Kit mg Lysozym in 500 µl TE Buffer lösen. 50 mg Lysozym in 5 ml TE Buffer lösen. 200 mg Lysozym in 20 ml TE Buffer lösen. Gelöstes Lysozym sollte aliquotiert bei 20 C gelagert und bei Bedarf frisch aufgetaut werden.! Alle Zentrifugationsschritte müssen bei C ausgeführt werden. peqgold Bacterial DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 3

7 GEFÄHRLICHE INHALTSSTOFFE peqgold Bacterial DNA Kit Bestandteile Signalwort / Symbole PerfectBind DNA Column ml Collection Tubes - DNA Lysis Buffer T DNA Binding Buffer - (not necessary) DANGER DNA Wash Buffer (Konz.) - Elution Buffer - 10 mm TE Buffer - RNase A (20 mg/ml) Proteinase K DANGER DANGER Gefährliche Inhaltsstoffe H- und P-Sätze sodium dodecyl, sulphate, CAS: propan-2-ol %, CAS: (not necessary) H225, H319, H336, P101, P102, P103, P210, P261, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P Nuclease, ribo- 20 mg/ml, CAS: Proteinase, Tritirachium album serine %, CAS: H317, H334, P261S, P280sh, P , P , P , P , P363 H319, H335, H315, H334, P280, P285, P305+P351+P338, P309+P311 peqgold Bacterial DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 4

8 H- und P-Sätze Erläuterungen H225 Flüssigkeit und Dampf leicht entzündbar. H315 Verursacht Hautreizungen. H317 Kann allergische Hautreaktionen verursachen. H319 Verursacht schwere Augenreizung. H334 Kann bei Einatmen Allergie, asthmaartige Symptome oder Atembeschwerden verursachen. H335 H336 P101 P102 P103 P210 P261 P261S P280 P280sh P285 P302+P352 P303+P361+P353 P304+P340 P305+P351+P338 P309+P311 P333+P313 P342+P311 P363 P405 P501 Kann die Atemwege reizen. Kann Schläfrigkeit und Benommenheit verursachen. Ist ärztlicher Rat erforderlich, Verpackung oder Kennzeichnungsetikett bereithalten. Darf nicht in die Hände von Kindern gelangen. Vor Gebrauch Kennzeichnungsetikett lesen. Von Hitze, heissen Oberflächen, Funken, offenen Flammen sowie anderen Zündquellenarten fernhalten. Nicht rauchen. Einatmen von Staub/Rauch/Gas/Nebel/Dampf/Aerosol vermeiden. Einatmen von Staub vermeiden Schutzhandschuhe/Schutzkleidung/Augenschutz/Gesichtsschutz tragen. Schutzhandschuhe/Augenschutz tragen. Bei unzureichender Lüftung Atemschutz tragen. BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT: Mit viel Wasser/ waschen. BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT (oder dem Haar): Alle kontaminierten Kleidungsstücke sofort ausziehen. Haut mit Wasser abwaschen/duschen. BEI EINATMEN: Die Person an die frische Luft bringen und für ungehinderte Atmung sorgen. BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser ausspülen. Eventuell vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter ausspülen. Bei Exposition oder Unwohlsein: Giftinformationszentrum, Arzt oder anrufen. Bei Hautreizung oder -ausschlag: Ärztlichen Rat einholen/ärztliche Hilfe hinzuziehen. Bei Symptomen der Atemwege: GIFTINFORMATIONSZENTRUM/Arzt/ anrufen. Kontaminierte Kleidung vor erneutem Tragen waschen. Unter Verschluss aufbewahren. Inhalt/Behälter zuführen. peqgold Bacterial DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 5

9 PEQGOLD BACTERIAL DNA ISOLIERUNGSPROTOKOLLE A. DNA-Isolation aus Bakterienpellets (gram - und gram + Bakterien) und Lyse mittels Lysozym Benötigte Materialien, die nicht mitgeliefert werden:! Schüttelwasserbad vorgewärmt auf 30 C und auf 70 C! 100 % Ethanol! Steriles, deionisiertes Wasser (optional)! Sterile RNase-freie Pipettenspitzen und Zentrifugenröhrchen 1. Zellwandverdau und Lyse Bakterienzellen bis zur log-phase in LB-Medium wachsen lassen und bis zu 1 x 10 9 Zellen durch Zentrifugation für 10 Minuten bei x g* pelletieren. Überstand vollständig abnehmen und verwerfen. Obwohl für Gesamtzell-DNA-Isolierungen im Zweifelsfall eher Kulturen in der log-phase eingesetzt werden sollten, können in vielen Fällen auch Übernachtkulturen verwendet werden. Pelletierte Zellen in TE Buffer nach Angabe untenstehender Tabelle resuspendieren und entsprechende Menge Lysozymlösung (10 mg/ml) zugeben. Bakterien TE Buffer Lysozym gram 190 µl 10 µl gram µl 100 µl Bakterien für ca. 10 Minuten in einem Schüttelwasserbad bei 30 C inkubieren. Bei gram + - Bakterien muss die Lysezeit unter Umständen auch verlängert werden. Abhängig vom jeweils zu bearbeitenden Bakterienstamm können größere Lysozymmengen oder längere Inkubationszeiten erforderlich sein. Der vollständige Verdau der Zellwand ist für den Erfolg der gesamten Präparation von entscheidender Bedeutung. Zellen für 5 Minuten bei x g* pelletieren und Überstand verwerfen. Pellet in 400 µl DNA Lysis Buffer T resuspendieren, 20 µl Proteinase K und 15 µl RNase A (20 mg/ml) zugeben und durch Vortexen für 10 sec mischen. Ansatz bis zur vollständigen Lyse der Bakterien bei 70 C in einem Schüttelwasserbad für 30 min inkubieren. Wenn kein Schüttelwasserbad verfügbar ist, den Ansatz während der Inkubationszeit 3 4 mal für 10 sec vortexen. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 27 peqgold Bacterial DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 6

10 2. Laden und Binden 200 µl DNA Binding Buffer zugeben und durch Pipettieren sorgfältig mischen. Eine PerfectBind DNA Column in ein 2.0 ml Collection Tube stecken und den gesamten Ansatz einschließlich aller Präzipitate auf die PerfectBind DNA Column laden. PerfectBind DNA Column im Tube für 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss und Collection Tube verwerfen. Vorgang eventuell wiederholen, bis das gesamte Lysat auf die PerfectBind DNA Column geladen ist. 3. Waschen I PerfectBind DNA Column in ein frisches 2.0 ml Collection Tube stecken und 650 µl des komplettierten DNA Wash Buffers (Pufferkonzentrat plus 1.5 Volumen abs. Ethanol) auf die PerfectBind DNA Column pipettieren. PerfectBind DNA Column im Tube für 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss und Collection Tube verwerfen. 4. Waschen II Nochmals mit 650 µl DNA Wash Buffer waschen, wie in Schritt 3 beschrieben. 5. Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!) PerfectBind DNA Column in das geleerte 2.0 ml Collection Tube stecken und durch zweiminütiges Zentrifugieren bei x g* vollständig trocknen. 6. Elution PerfectBind DNA Column in ein sauberes 1.5 ml Zentrifugenröhrchen stecken und die DNA mit µl Elution Buffer oder sterilem, deionisierten Wasser eluieren. Dazu direkt auf die Matrix pipettieren und für 3 Minute bei Raumtemperatur inkubieren. Im Anschluss für 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Bei jeder Elution mit µl Elution Buffer werden bis zu 70 % der gebundenen DNA eluiert. Zwei Elutionsrunden ermöglichen deshalb eine Wiederfindungsrate von rund 90 %. Dabei ist allerdings zu beachten, dass mehrere Elutionsrunden zwar den absoluten Ertrag erhöhen, dafür jedoch die Konzentration erniedrigen. Puffervolumina unter 50 µl führen zu erheblich geringeren Erträgen. Durch eine Inkubation der PerfectBind DNA Column bei 70 C anstatt bei Raumtemperatur oder der Verwendung von auf 70 C vorgewärmten Elution Buffer kann der Elutionsertrag noch etwas erhöht werden. Für die zweite Elution kann auch das erste Eluat verwendet werden. Dadurch wird bei höherer Endkonzentration ebenfalls der Gesamtertrag verbessert. Er bleibt aber ca. 30 % hinter dem Ertrag zurück, der bei einer Nachelution mit einem zweiten Aliquot Elution Buffer erreicht werden kann. Die erwarteten DNA-Erträge variieren je nach bearbeiteter Bakterienspezies und Plasmidgehalt zwischen rund µg DNA mit einem A 260/280-Verhältnis von 1.7 bis 1.9 je 3 ml Ausgangskulturvolumen. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 27 peqgold Bacterial DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 7

11 B. DNA-Isolation aus schwer aufschließbaren Bakterien, z.b. Mycobakterien (alternative Varianten) Benötigte Materialien, die nicht mitgeliefert werden:! Schüttelwasserbad vorgewärmt auf 50 C und auf 95 C! 100 % Ethanol! Steriles, deionisiertes Wasser (optional)! Sterile RNase-freie Pipettenspitzen und Zentrifugenröhrchen 1. Zellwandverdau und Lyse Zellen durch Zentrifugation für 10 Minuten bei x g* pelletieren. Überstand vollständig abnehmen und verwerfen. a. Pelletierte Zellen in 200 µl TE Buffer resuspendieren. Für 20 Minuten in einem Schüttelwasserbad bei 95 C inkubieren. oder b. Pelletierte Zellen in 200 µl TE Buffer resuspendieren. Für 3 Minuten bei 95 C, danach für 2 Minuten in einem Methanol oder Ethanol-Trockeneisbad inkubieren. Diese Schritte insgesamt 5 mal durchführen. Zellen für 5 Minuten bei x g* pelletieren und Überstand verwerfen. Pellet in 400 µl DNA Lysis Buffer T resuspendieren, 20 µl Proteinase K und 15 µl RNase A (20 mg/ml) zugeben und durch Vortexen für 10 sec mischen. Ansatz bei 50 C für 30 Minuten in einem Schüttelwasserbad inkubieren. Wenn kein Schüttelwasserbad verfügbar ist, den Ansatz während der Inkubationszeit 3 4 mal für 10 sec vortexen. 2. Laden und Binden 200 µl DNA Binding Buffer zugeben und durch Pipettieren sorgfältig mischen. Eine PerfectBind DNA Column in ein 2.0 ml Collection Tube stecken und den gesamten Ansatz einschließlich aller Präzipitate auf die PerfectBind DNA Column laden. PerfectBind DNA Column im Tube für 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss und Collection Tube verwerfen. Vorgang eventuell wiederholen, bis das gesamte Lysat auf die PerfectBind DNA Column geladen ist. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 27 peqgold Bacterial DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 8

12 3. Waschen I PerfectBind DNA Column in ein frisches 2.0 ml Collection Tube stecken und 650 µl des komplettierten DNA Wash Buffers (Pufferkonzentrat plus 1.5 Volumen absolutes Ethanol) auf die PerfectBind DNA Column pipettieren. PerfectBind DNA Column im Tube für 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss und Collection Tube verwerfen. 4. Waschen II Nochmals mit 650 µl DNA Wash Buffer waschen, wie in Schritt 3 beschrieben. 5. Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!) PerfectBind DNA Column in das geleerte 2.0 ml Collection Tube stecken und durch zweiminütiges Zentrifugieren bei x g* vollständig trocknen. 6. Elution PerfectBind DNA Column in ein sauberes 1.5 ml Zentrifugenröhrchen stecken und die DNA mit µl Elution Buffer oder sterilem, deionisierten Wasser eluieren. Dazu direkt auf die Matrix pipettieren und für 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Im Anschluss für 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Bei jeder Elution mit µl Elution Buffer werden bis zu 70 % der gebundenen DNA eluiert. Zwei Elutionsrunden ermöglichen deshalb eine Wiederfindungsrate von rund 90 %. Dabei ist allerdings zu beachten, dass mehrere Elutionsrunden zwar den absoluten Ertrag erhöhen, dafür jedoch die Konzentration erniedrigen. Puffervolumina unter 50 µl führen zu erheblich geringeren Erträgen. Durch eine Inkubation der PerfectBind DNA Column bei 70 C anstatt bei Raumtemperatur oder Verwendung von auf 70 C vorgewärmten Elution Buffer kann der Elutionsertrag noch etwas erhöht werden. Für die zweite Elution kann auch das erste Eluat verwendet werden. Dadurch wird bei höherer Endkonzentration ebenfalls der Gesamtertrag verbessert. Er bleibt aber ca. 30 % hinter dem Ertrag zurück, der bei einer Nachelution mit einem zweiten Aliquot Elution Buffer erreicht werden kann. Die erwarteten DNA-Erträge variieren je nach bearbeiteter Bakterienspezies und Plasmidgehalt zwischen rund µg DNA mit einem A 260/280-Verhältnis von 1.7 bis 1.9 je 3 ml Ausgangskulturvolumen. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 27 peqgold Bacterial DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 9

13 AUFKONZENTRIERUNG DER DNA Genomische DNA, die mit dem peqgold Bacterial DNA Kit aufgereinigt wurde, kann bei Bedarf noch weiter konzentriert werden. Hierzu NaCl bis zu einer Endkonzentration von 0.1 M und danach 2 Volumen absolutes Ethanol zugeben. Ansatz durch Vortexen sorgfältig mischen und für rund 10 Minuten bei 20 C inkubieren. Danach für 15 Minuten bei x g* zentrifugieren und Überstand verwerfen. 700 µl 80 % Ethanol zugeben und für 2 Minuten bei x g* zentrifugieren. Überstand verwerfen, Pellet für 2 Minuten lufttrocknen und DNA in 20 µl sterilem, deionisierten Wasser oder 10 mm Tris- HCl, ph 9.0 lösen. QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER DNA Um die Konzentration und Reinheit einer DNA-Lösung zu bestimmen, muss die Absorption eines geeignet verdünnten Aliquots (10- bis 50-fach) bei 260 nm und 280 nm gemessen werden. Eine A 260-Einheit entspricht dabei 50 µg DNA/ml. Die Konzentration berechnet sich demnach wie folgt: DNA-Konzentration (µg/ml) = Absorption 260 x 50 x Verdünnungsfaktor Das A 260/280-Verhältnis reiner Nukleinsäuren liegt bei 2.0. Das mit dem peqgold Bacterial DNA Kit erzielbare Verhältnis von 1.7 bis 1.9 entspricht deshalb genomischer DNA mit einer Reinheit von 85 % bis 95 %. Alternativ können der ungefähre Ertrag und die Qualität der erhaltenen DNA auch durch Agarosegelelektrophorese mit anschließender Ethidiumbromidfärbung und Vergleich mit bekannten DNA-Proben bestimmt werden. Genomische DNA, die mit dem peqgold Bacterial DNA Kit aufgereinigt wurde, kann in Elution Buffer, 10 mm Tris-HCl (ph 9.0) oder sterilem, deionisierten Wasser für mehrere Jahre bei 20 C aufbewahrt werden. Dabei ist zu beachten, dass häufiges Auftauen und Einfrieren zum Scheren der DNA und damit zu einer sukzessiven Reduktion der Molekülgrößen führt. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 27 peqgold Bacterial DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 10

14 BESTELLINFORMATIONEN für die DNA- und RNA-Isolierung aus Bakterien: peqgold Bacterial DNA Mini Kit Reinigungen Reinigungen Reinigungen peqgold Bacterial RNA Mini Kit Reinigungen Reinigungen Reinigungen peqgold Bacterial DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 11

15 TROUBLESHOOTING TIPS Problem Ursache Abhilfe PerfectBind DNA Column verstopft Unvollständiger Zellwandverdau Unvollständige Lyse Mehr Lysozym zugeben oder Inkubation um 15 Minuten verlängern. Korrektes Volumen DNA Binding Buffer zugeben und für 30 Minuten bei 70 C inkubieren. Keine DNA im Eluat Schlechtes A 260/280- Verhältnis Probenvolumen zu groß Maximal 3 ml Ausgangskultur einer OD 600 von 10 oder 1 x 10 9 Zellen verwenden. Bei größerem Volumen mehrere PerfectBind DNA Columns und entsprechende Puffervolumina einsetzen. Unvollständige Spheroblastenbildung Schlechte Lyse durch unzureichendes Mischen mit DNA Binding Buffer DNA Wash Buffer nicht mit absolutem Ethanol verdünnt Säulenmaterial im Eluat Schlechte Lyse durch unzureichendes Mischen mit DNA Binding Buffer Unvollständige Lyse oder Proteindegradation durch zu kurze Inkubation Mehr Lysozym zugeben oder Inkubation um 15 Minuten verlängern. Nach Zugabe von DNA Binding Buffer sorgfältiger mischen. DNA Wash Buffer-Konzentrat mit 1.5 Volumen Ethanol verdünnen. Während der Elution nicht länger und nicht höher zentrifugieren als angegeben. Säulenmaterial interferiert nicht mit Enzymreaktionen und kann durch Pelletieren entfernt werden. Nach Zugabe von DNA Binding Buffer sorgfältiger mischen. Inkubationszeit in DNA Lysis Buffer T mit Proteinase K verlängern, bis keine Zellklumpen mehr zu erkennen sind. peqgold Bacterial DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 12

16 TROUBLESHOOTING TIPS (Fortsetzung) Problem Ursache Abhilfe Niedriger DNA-Ertrag Schlechte Elution Elution wiederholen oder Volumen des Elution Buffer erhöhen. PerfectBind DNA Column nach dem Auftragen des Elution Buffers zunächst für 5 Minuten bei 70 C inkubieren oder auf 70 C vorgewärmten Elution Buffer verwenden. Probleme bei Folgeanwendungen DNA vor der Elution von der PerfectBind DNA Column gewaschen PerfectBind DNA Column verstopft Salzübertragung Ethanolübertragung Das DNA Wash Buffer-Konzentrat muss vor seiner Verwendung mit 1.5 Volumen mit 1.5 Volumen absolutem Ethanol verdünnt werden. Siehe oben. DNA Wash Buffer muss Raumtemperatur haben. Nach dem zweiten Waschen muss die PerfectBind DNA Column durch Zentrifugieren für 2 Minuten bei x g* getrocknet werden. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 27 peqgold Bacterial DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 13

17 INTRODUCTION The peqgold Bacterial DNA Kit allows rapid and reliable isolation of high-quality genomic DNA from a wide variety of Bacterial species. Up to 1 x 10 9 bacterial cells can be processed in less than 2 hours. The system combines the reversible nucleic acidbinding properties of PerfectBind matrix with the speed and versatility of PerfectBind DNA Column technology to yield approximately up to 30 µg of DNA with. There is no need for phenol/chloroform extractions. Time-consuming steps such as CsCl gradient ultracentrifugation or precipitation with isopropanol or ethanol are eliminated. Purified DNA is suitable for PCR, restriction digestion, and hybridization techniques. There are no organic extractions, thus reducing plastic waste and hands-on time to allow multiple samples to be processed in parallel. Total cell DNA purified using the peqgold Bacterial DNA Mini Kit is ready for applications such as PCR, Southern blotting or RFLP analysis. THEORY The peqgold Bacterial DNA Kit uses the reversible nucleic acid-binding properties of the PerfectBind matrix, combined with the speed of mini-column spin technology. A specifically formulated buffer system allows up to 30 µg of genomic DNA with fragment lengths up to 60 kbp to bind to the matrix. Bacterial cells are grown to log phase and harvested. Bacterial cell wall is removed by lysozyme digestion and followed by Proteinase K digestion. Following lysis, binding conditions are adjusted and the sample applied to a PerfectBind DNA Column. Two rapid wash steps remove trace salt and protein contaminants and finally DNA is eluted in water or Elution Buffer. Purified DNA can be directly used in downstream applications without the need for further purification. peqgold Bacterial DNA Kit Ord.-No PEQLAB_v0815_E 14

18 KIT COMPONENTS peqgold Bacterial DNA Kits 5 Purifications 50 Purifications 200 Purifications Product Number Components PerfectBind DNA Columns ml Collection Tubes DNA Lysis Buffer T 2 ml 24 ml 90 ml DNA Binding Buffer 1.5 ml 12 ml 45 ml DNA Wash Buffer (conc.) 4 ml 40 ml 3 x 40 ml (konz.) Elution Buffer 2 x 1.5 ml 25 ml 60 ml 10 mm TE Puffer 2 ml 20 ml 80 ml RNase A (20 mg/ml) 80 µl 800 µl 2 x 1.6 ml Lysozyme 5 mg 50 mg 200 mg Proteinase K 3 mg 30 mg 120 mg Instruction Manual STORAGE AND STABILITY Please store undissolved Proteinase K and lysozyme cool and dry at 4 C or 20 C. Dissolved Proteinase K and lysozyme has to be stored in aliquots at 20 C. RNase A should be stored at 4 C, all other kit components should be stored at room temperature (22 to 25 C) and will then remain stable for at least 12 months after the date of purchase. During shipment crystals may form in the DNA Binding Buffer. Warm up to 37 C to dissolve. BINDING CAPACITY The binding capacity of a PerfectBind DNA Column is 30 µg DNA. Do not use more cell material than indicated. peqgold Bacterial DNA Mini Ord.-No.: PEQLAB_v0815_E 15

19 BEFORE STARTING Briefly examine this booklet and become familiar with each step. Prepare all components and have the necessary materials ready before starting.! DNA Binding Buffer contains a chaotropic salt. Use gloves and protective eyeware when handling this solution.! Under cool ambient conditions, crystals may form in the DNA Binding Buffer. This is normal and the bottle should be warmed to 37 C to dissolve the salt before use.! DNA Wash Buffer is concentrated and has to be diluted with absolute ethanol as follows: Kit Kit Kit Add 6 ml 100 % EtOH to 4 ml DNA Wash Buffer. Add 60 ml 100 % EtOH to 40 ml DNA Wash Buffer. Add 3 x 60 ml 100 % EtOH to 3 x 40 ml DNA Wash Buffer. Store diluted DNA Wash Buffer at room temperature.! Prepare Proteinase K stock solution as following: Kit Kit Kit Dissolve 3 mg Proteinase K in 150 µl TE Buffer. Dissolve 30 mg Proteinase K in 1.5 ml TE Buffer. Dissolve 120 mg Proteinase K in 6 ml TE Buffer. Dissolved Proteinase K has to be stored in aliquots at 20 C and be freshly thawed before use.! Prepare Lysozyme stock solution (10 mg/ml) as following: Kit Kit Kit Dissolve 5 mg Lysozyme in 500 µl TE Buffer. Dissolve 50 mg Lysozyme in 5 ml TE Buffer. Dissolve 200 mg Lysozyme in 20 ml TE Buffer. Dissolved Lysozyme has to be stored in aliquots at 20 C and be freshly thawed before use.! All steps must be carried out at room temperature (22 25 C). peqgold Bacterial DNA Mini Ord.-No.: PEQLAB_v0815_E 16

20 DANGEROUS COMPONENTS peqgold Bacterial DNA Kit Components Signal word / symbols PerfectBind DNA Column ml Collection Tubes - DNA Lysis Buffer T DNA Binding Buffer - (not necessary) DANGER DNA Wash Buffer (Konz.) - Elution Buffer - 10 mm TE Buffer - RNase A (20 mg/ml) Proteinase K DANGER DANGER Dangerous components H and P statements sodium dodecyl, sulphate, CAS: propan-2-ol %, CAS: (not necessary) H225, H319, H336, P101, P102, P103, P210, P261, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P Nuclease, ribo- 20 mg/ml, CAS: Proteinase, Tritirachium album serine %, CAS: H317, H334, P261S, P280sh, P , P , P , P , P363 H319, H335, H315, H334, P280, P285, P305+P351+P338, P309+P311 peqgold Bacterial DNA Mini Ord.-No.: PEQLAB_v0815_E 17

21 H and P statements H225 H315 H317 H319 H334 H335 H336 P101 P102 P103 P210 P261 P261S P280 P280sh P285 P302+P352 P303+P361+P353 P304+P340 P305+P351+P338 P309+P311 P333+P313 P342+P311 P363 P405 P501 Descriptions Highly flammable liquid and vapour. Causes skin irritation. May cause an allergic skin reaction. Causes serious eye irritation. May cause allergy or asthma symptoms or breathing difficulties if inhaled. May cause respiratory irritation. May cause drowsiness or dizziness. If medical advice is needed, have product container or label at hand. Keep out of reach of children. Read label before use. Keep away from heat, hot surfaces, sparks, open flames and other ignition sources. No smoking. Avoid breathing dust/fume/gas/mist/vapours/spray. Avoid breathing dust. Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face protection. Wear protective gloves/eye protection. In case of inadequate ventilation wear respiratory protection. IF ON SKIN: Wash with plenty of water/ IF ON SKIN (or hair): Take off immediately all contaminated clothing. Rinse skin with water/shower. IF INHALED: Remove person to fresh air and keep comfortable for breathing. IF IN EYES: Rinse cautiously with water for several minuts. Remove contact lenses, if present and easy to do. Continue rinsing. IF exposed or concerned: Get medical advice/attention. If skin irritation or rash occurs: Get medical advice/attention. If experiencing respiratory symptoms: Call a POISON CENTER/doctor/ Wash contaminated clothing before reuse. Store locked up. Dispose of contents/container to peqgold Bacterial DNA Mini Ord.-No.: PEQLAB_v0815_E 18

22 PEQGOLD BACTERIAL DNA ISOLATION PROTOCOL A. DNA-Isolation from bacterial pellets (gram - und gram + bacteria) and lysis with lysozyme Materials required, but not supplied:! Shaking waterbath set to 30 C and 70 C! Absolute (96 % 100 %) ethanol! Sterile dh 2O (optional)! Nuclease-free 1.5 ml tubes 1. Homogenization and lysis Grow Bacteria in LB media to log phase. (Overnight culture can be used in many cases.) Harvest no more than 1 x 10 9 cells by centrifugation at x g* for 10 min at room temperature. Resuspend cell pellet in TE Buffer and add amount of lysozyme solution (10 mg/ml) as described in the table below. Bacteria TE Buffer Lysozyme gram 190 µl 10 µl gram µl 100 µl Incubate cells for 10 min at 30 C in a shaking water bath. The lysis time for gram + might need to be increased for certain species. Note: The amount of enzyme required and/or the incubation time may need to be modified depending on the bacterial strain used. Complete digestion of the cell wall is essential for efficient lysis Pellet digested cells by centrifuging for 5 min at x g* at room temperature. Resuspend cell pellet in 400 µl DNA Lysis Buffer T, add 20 µl of a Proteinase K solution and 15 µl RNase A (20 mg/ml). Vortex for 10 sec to mix well, and incubate at 70 C in a shaking water bath for 30 min to effect complete lysis. If no shaking water bath is available, vortex the sample 3 4 times for 10 sec during incubation. * Translation of g (rcf) / rpm see Appendix, page 27 peqgold Bacterial DNA Mini Ord.-No.: PEQLAB_v0815_E 19

23 2. Load and Bind Add 200 µl DNA Binding Buffer and mix well by pipetting. Assemble a PerfectBind DNA Column in a 2.0 ml Collection Tube. Transfer the entire lysate into the column including any precipitate that may have formed to the PerfectBind DNA Column. Centrifuge at x g* for 1 min to bind DNA. Discard the flowthrough and Collection Tube. 3. Wash I Place the column into a fresh 2.0 ml Collection Tube and wash by adding 650 µl of DNA Wash Buffer completed with 1.5 volumes of 100 % ethanol. Centrifuge at x g* for 1 min. Discard flow-through and Collection Tube. 4. Wash II Repeat the washing step as described in step 3 with another 650 µl of DNA Wash Buffer. Keep the Collection Tube for the next step. 5. Dry (Important, do not skip this step!) Place the PerfectBind DNA Column containing your DNA in the 2.0 ml Collection Tube used in step 4 and centrifuge for 2 min at x g* to dry the column matrix. 6. Elution Place the column into a sterile 1.5 ml microfuge tube and add µl of Elution Buffer or sterile dh 2O. Allow tubes to sit for 3 min at room temperature. To elute DNA from the column, centrifuge at x g* for 1 min. With every elution with µl Elution Buffer or sterile deionized water, up to 70 % of bound DNA will be eluted. Two elution rounds allow a recovery rate of approx. 90 %. Consider that multiple elution rounds increase the DNA yield but decrease the concentration. However buffer volumes under 50 µl result in a clear reduction of the yield. A 5 minute incubation of the PerfectBind DNA Column at 70 C instead of room temperature or usage of 70 C prewarmed Elution Buffer can increase the yield. For the second elution the first eluate can be also used. Thereby the total yield will be increased with a higher end concentration. But it drops behind approx. 30 % of the yield which can be achieved with a second aliquot of Elution Buffer. Total DNA yields vary depending on bacteria species and plasmid content. Typically, µg DNA with an A 260/280 ratio of can be isolated using 3 ml starting volume. * Translation of g (rcf) / rpm see Appendix, page 27 peqgold Bacterial DNA Mini Ord.-No.: PEQLAB_v0815_E 20

24 B. DNA-Isolation from hardly lysable bacteria, e.g. mycobacteria (alternative variants) Materials required, but not supplied:! Shaking waterbath set to 50 C and 95 C! Absolute (96 % 100 %) ethanol! Sterile dh 2O (optional)! Nuclease-free 1.5 ml tubes 1. Homogenization and lysis Pellet cells by centrifugation at x g* for 10 min at room temperature. a. Discard medium and resuspend cells in 200 µl TE Buffer followed by 20 min incubation at 95 C in a shaking water bath. or: b. Resuspend cells in 200 µl TE Buffer followed by 3 min incubation at 95 C and 2 min incubation in a methanol or ethanol dry ice bath. Repeat these steps 5 times. Pellet digested cells by centrifuging for 5 min at x g* at room temperature and discard supernatant. Resuspend cells in 400 µl DNA Lysis Buffer T, add 20 µl of a Proteinase K solution and 15 µl RNase A (20 mg/ml). Vortex for 10 sec to mix well and incubate at 50 C for 30 min in a shaking water bath to effect complete lysis. If no shaking water bath is available, vortex the sample 3 4 times for 10 sec during incubation. 2. Load and Bind Add 200 µl DNA Binding Buffer and mix well by pipetting. Assemble a PerfectBind DNA Column in a 2.0 ml Collection Tube. Transfer the entire sample into the column including any precipitate that may have formed. Centrifuge at x g* for 1 min to bind DNA. Discard flow-through and Collection Tube. 3. Wash I Place the column into a fresh 2.0 ml Collection Tube and wash by adding 650 µl of DNA Wash Buffer (completed with 1.5 volumes of 100 % ethanol) diluted with ethanol. Centrifuge at x g* for 1 min. Discard flow-through and Collection Tube. * Translation of g (rcf) / rpm see Appendix, page 27 peqgold Bacterial DNA Mini Ord.-No.: PEQLAB_v0815_E 21

25 4. Wash II Repeat the washing step as described in step 3 with another 650 µl of DNA Wash Buffer. Keep the Collection Tube for the next step. 5. Dry (Important, do not skip this step!) Place the PerfectBind DNA Column in the 2.0 ml Collection Tube and centrifuge for 2 min at x g* to dry the column matrix. 6. Elution Place the column into a sterile 1.5 ml microfuge tube and add µl of Elution Buffer or sterile dh 2O. Allow tubes to sit for 3 min at room temperature. To elute DNA from the column, centrifuge at x g* for 1 min. With every elution with µl Elution Buffer or sterile deionized water, up to 70 % of bound DNA will be eluted. Two elution rounds allow a recovery rate of approx. 90 %. Consider that multiple elution rounds increase the DNA yield but decrease the concentration. However buffer volumes under 50 µl result in a clear reduction of the yield. A 5 minute incubation of the PerfectBind DNA Column at 70 C instead of room temperature or usage of 70 C prewarmed Elution Buffer can increase the yield. For the second elution the first eluate can also be used. Thereby the total yield will be increased with a higher end concentration. But it drops behind approx. 30 % of the yield which can be achieved with a second aliquot of Elution Buffer. Total DNA yields vary depending on bacteria species and plasmid content. Typically, µg DNA with an A 260/280 ratio of can be isolated using 3 ml starting volume. * Translation of g (rcf) / rpm see Appendix, page 27 peqgold Bacterial DNA Mini Ord.-No.: PEQLAB_v0815_E 22

26 CONCENTRATING THE DNA Genomic DNA purified with the peqgold Bacterial DNA Kit can be further concentrated if required. Add NaCl to an end concentration of 0.1 M and 2 sample volumes of absolute ethanol. Mix thoroughly by vortexing and incubate for 10 minutes at 20 C. Centrifuge for 15 minutes at x g* and discard the supernatant. Add 700 µl of 80 % ethanol and centrifuge for 2 minutes at x g*. Discard the supernatant, air-dry the pellet for 2 minutes and dissolve the DNA in 20 µl of sterile, deionised water or 10 mm Tris-HCl, ph 9.0. QUANTITATION AND STORAGE OF DNA To determine the concentration and the purity of a DNA containing solution, the absorbance of a 10- to 50-fold diluted aliquot is measured at 260 nm and 280 nm in a spectrophotometer. One A 260 unit corresponds to 50 µg of DNA per ml. The concentration can be determined as follows: DNA concentration (µg/ml) = absorbance 260 x 50 x dilution factor The A 260/280 ratio of pure nucleic acids is 2.0. Generally genomic DNA isolated with the peqgold Blood DNA Mini Kit shows ratios between 1.7 and 1.9 corresponding to a purity of 85 % to 95 %. Alternatively the approximate yield and the quality of the received DNA can also be determined by agarose gel electrophoresis with subsequent ethidium bromide staining and comparison with well-known DNA samples. Genomic DNA isolated with peqgold Blood DNA Kits can be stored at 20 C for years if eluted in Elution buffer, 10 mm Tris-HCl, ph 9.0 or sterile, deionized water. Repeated freeze-thaw-cycles can result in shearing of the DNA and therefore successive reduction of fragment lengths can occur. * Translation of g (rcf) / rpm see Appendix, page 27 peqgold Bacterial DNA Mini Ord.-No.: PEQLAB_v0815_E 23

27 ORDERING INFORMATION For DNA and RNA isolation from bacterial peqgold Bacterial DNA Mini Kit Preparations Preparations Preparations peqgold Bacterial RNA Mini Kit Preparations Preparations Preparations peqgold Bacterial DNA Mini Ord.-No.: PEQLAB_v0815_E 24

28 TROUBLESHOOTING TIPS Problem Likely cause Suggestion Clogged column Incomplete lysis Add the correct volume of DNA Lysis Buffer T and incubate at 70 C to obtain complete lysis. It may be necessary to extend incubation time to 30 min. Sample volume too large Incomplete removal of cell wall Low DNA yield Clogged column See above. Do not use greater than 3 ml culture at OD or 1 x 10 9 cells per PerfectBind DNA Column. For larger volumes, divide sample into multiple tubes. Add more lysozyme or extend the incubation time. It may be necessary to increase incubation by 15 min. Low A 260/A 280 ratio Poor elution Improper washing Extended centrifugation during elution step Poor cell lysis due to incomplete mixing with DNA Binding Buffer Matrix material in the eluate Incomplete lysis or protein degradation due to too short incubation Repeat elution or increase elution volume (see note on page 6). Incubation of column at 70 C for 5 min or usage of 70 C prewarmed dh 2O or Elution Buffer may increase yields. DNA Wash Buffer Concentrate must be diluted with absolute (100 %) ethanol as specified on page 14 before use. Resin from the column may be present in eluate. Avoid centrifugation at speeds higher than specified. The material can be removed from the eluate by centrifugation - it will not interfere with PCR or restriction digests. Repeat the procedure, this time making sure to mix the sample with DNA Binding Buffer immediately and completely. Do not centrifuge longer or faster as described. Matrix material does not interfere with enzyme reactions and can be removed by pelleting Extend incubation in DNA Lysis Buffer T with Proteinase K until there are no more cell clumps. * Translation of g (rcf) / rpm see Appendix, page 27 peqgold Bacterial DNA Mini Ord.-No.: PEQLAB_v0815_E 25

29 TROUBLESHOOTING TIPS (Continuation) Problem Likely cause Suggestion No DNA in the eluate Incomplete generation of Add more lysozyme or extend incubation for spheroblasts 15 min. Poor cell lysis due to incomplete mixing with DNA Binding Buffer See above. DNA Wash Buffer not diluted with absolute ethanol Dilute DNA Wash Buffer concentrate with 1.5 volume of ethanol. Problems with downstream applications Transfer of salt DNA Wash Buffer must have room temperature. Transfer of ethanol After second wash step dry the PerfectBind DNA Column by centrifuging for 2 min at x g*. * Translation of g (rcf) / rpm see Appendix, page 27 peqgold Bacterial DNA Mini Ord.-No.: PEQLAB_v0815_E 26

30 APPENDIX Abb. 1: Umrechnungstabelle rcf/rpm. Werte für Zentrifugen, abhängig vom Rotordurchmesser. Fig. 1: Table rcf/rpm. Values for centrifuges depending on rotor diameter. peqgold Bacterial DNA Kit Ord.-No PEQLAB_v0815_E 27

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