peqgold Gel Extraction Kit

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1 Arbeitsanleitung Instruction Manual peqgold Gel Extraction Kit (Classic-Line & Safety-Line) V0815

2 INHALT EINLEITUNG 1 FUNKTIONSPRINZIP 1 VORTEILE 1 KITBESTANDTEILE 2 LAGERUNG 2 WICHTIGE HINWEISE 3 GEFÄHRLICHE INHALTSSTOFFE 3 PEQGOLD GEL EXTRACTION PROTOKOLL 4 A. Extraktion von DNA aus Agarosegelen 4 B. Extraktion von DNA aus Reaktionsansätzen 7 QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER DNA 8 BESTELLINFORMATIONEN 9 TROUBLESHOOTING TIPS 10 CONTENT INTRODUCTION 12 PRINCIPLE 12 BENEFITS 12 KIT COMPONENTS 13 STORAGE AND STABILITY 13 BEFORE STARTING 14 DANGEROUS COMPONENTS 14 PEQGOLD GEL EXTRACTION PROTOCOL 15 A. Extraction of DNA from Agarose gels 15 B. Extraction of DNA from PCR reaction 18 YIELD AND QUALITIY OF DNA 18 ORDERING INFORMATION 19 TROUBLESHOOTING TIPS 20 APPENDIX 21

3 EINLEITUNG Die Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen ist eine gängige Technik, um spezifische Fragmente aus komplexen Reaktionsgemischen zu isolieren. Dabei ist die vollständige Entfernung der Agarose in vielen Fällen ein Problem, mit nachteiligen Auswirkungen auf Folgeanwendungen. Es kann ferner zum Scheren der DNA oder zu unbefriedigend niedrigen Erträgen kommen Schwierigkeiten, die bei Verwendung der peqgold Gel Extraction Kits nicht auftreten. Mit seiner Hilfe können aus allen Arten von Agarosegelen DNA-Fragmente mit Molekülgrößen zwischen 50 bp und 40 kb extrahiert werden, wobei Wiederfindungsraten von 90 % bis 95 % erreichbar sind. Jede PerfectBind DNA Column kann bis zu 30 µg DNA binden. DNA, die mit den peqgold Gel Extraction Kits extrahiert wurde, kann direkt für alle Arten von Folgeexperimenten, wie Ligationen, PCRs, Sequenzierungen, Restriktionsverdaus und unterschiedlichste Labeling-Reaktionen eingesetzt werden. peqgold Gel Extraction Kits werden wahlweise mit Safety-Line oder mit Classic-Line Säulen geliefert (Safety-Line, Best.-Nr xx oder Classic-Line, Best.-Nr xx). Schnappdeckel sorgen bei den Safety-Line Säulen für einen sicheren Verschluss und für einen zusätzlichen Schutz vor Kreuzkontaminationen. Classic-Line Säulen haben keinen Deckel und erleichtern so das Handling. FUNKTIONSPRINZIP Das Gelstück mit der interessierenden DNA-Bande wird ausgeschnitten und in Binde- Puffer gelöst. Die erhaltene Lösung wird durch eine PerfectBind DNA Column zentrifugiert, in der die DNA reversibel an eine PerfectBind-Silikamembran bindet. Nach zwei bis drei kurzen Waschschritten wird die gereinigte DNA mit Niedrigsalzpuffer oder deionisiertem Wasser eluiert. VORTEILE! Schnelligkeit DNA-Extraktionen in weniger als 15 Minuten.! Zuverlässigkeit Optimierte Puffer garantieren reinste DNA.! Sicherheit Keine Notwendigkeit für organische Extraktionen.! Qualität Für alle Folgeanwendungen geeignete DNA. peqgold Gel Extraction Kit Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 1

4 KITBESTANDTEILE peqgold Gel Extraction Kits 5 Reinigungen 50 Reinigungen 200 Reinigungen Bestellnummer Safety-Line Bestellnummer Classic-Line Bestandteile PerfectBind DNA Columns ml Collection Tubes Binding Buffer 3 ml 30 ml 120 ml CG Wash Buffer 5 ml 20 ml 3 x 20 ml Elution Buffer (10 mm Tris-HCl, ph 9.0) 1 ml 10 ml 30 ml Arbeitsanleitung LAGERUNG Die Aufbewahrung des peqgold Gel Extraction Kits sollte bei Raumtemperatur erfolgen. Bei einer Umgebungstemperatur von C bleiben die Komponenten des Kits für mindestens 12 Monate ab Lieferung stabil. Es muss darauf geachtet werden, dass die Flasche mit Binding Buffer zwischen zwei Anwendungen immer dicht verschlossen ist. peqgold Gel Extraction Kit Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 2

5 WICHTIGE HINWEISE Bitte lesen Sie das vorliegende Protokoll vor der ersten Verwendung des Kits vollständig durch und legen Sie vor Präparationsbeginn alle für die Isolierung benötigten Materialien bereit. Das Arbeiten mit peqgold Kits liefert zuverlässig sehr gute Resultate, wenn die Extraktionen sorgfältig nach den Anweisungen der Protokolle ausgeführt werden.! Der CG Wash Buffer wird als Konzentrat geliefert und muss vor seiner ersten Verwendung mit absolutem Ethanol verdünnt werden: ml CG Wash Buffer mit 20 ml 100 % EtOH mischen. 20 ml CG Wash Buffer mit 80 ml 100 % EtOH mischen. 3 x 20 ml CG Wash Buffer mit 3 x 80 ml 100 % EtOH mischen.! Verdünnten CG Wash Buffer bei RT lagern.! Alle Zentrifugationsschritte müssen bei C ausgeführt werden.! Die im Kit enthaltenen Mengen an DNA Binding Buffer sind für die Isolierung von DNA aus Gelstücken bis 600 µg ausgelegt. Sie reichen nicht für die regelmäßige DNA-Isolierung aus größeren Gelstücken, können hierfür jedoch separat nachbestellt werden.! Bei regelmäßiger Anwendung des optionalen Waschschrittes für in vitro Transkription und Mikroinjektion reicht der CG Wash Buffer nicht aus. Er kann hierfür jedoch separat nachbestellt werden. GEFÄHRLICHE INHALTSSTOFFE peqgold Gel Extraction Kits Bestandteile Signalwort / Symbole Gefährliche Inhaltsstoffe H- und P-Sätze PerfectBind DNA Columns ml Collection Tubes Binding Buffer DANGER guanidinium thiocyanate %, acetic acid 1-2.5%, polyethylene glycol octylphenol ether 0.3- <1%, CAS: , , H302+H312+H332, H314, H412, P101, P102, P103, P260, P280, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 CG Wash Buffer Elution Buffer (10 mm Tris-HCl, ph 9.0) peqgold Gel Extraction Kit Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 3

6 H- und P-Sätze Erläuterungen H302+H312+H332 Gesundheitsschädlich bei Verschlucken, Hautkontakt oder Einatmen. H314 H412 P101 P102 P103 P260 P280 P303+P361+P353 P305+P351+P338 P405 P501 Verursacht schwere Verätzungen der Haut und schwere Augenschäden. Schädlich für Wasserorganismen, mit langfristiger Wirkung. Ist ärztlicher Rat erforderlich, Verpackung oder Kennzeichnungsetikett bereithalten. Darf nicht in die Hände von Kindern gelangen. Vor Gebrauch Kennzeichnungsetikett lesen. Staub/Rauch/Gas/Nebel/Dampf/Aerosol nicht einatmen. Schutzhandschuhe/Schutzkleidung/Augenschutz/Gesichtsschutz tragen. BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT (oder dem Haar): Alle kontaminierten Kleidungsstücke sofort ausziehen. Haut mit Wasser abwaschen/duschen. BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser ausspülen. Eventuell vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter ausspülen. Unter Verschluss aufbewahren. Inhalt/Behälter zuführen. PEQGOLD GEL EXTRACTION PROTOKOLL A. Extraktion von DNA aus Agarosegelen Benötigte Materialien, die nicht mitgeliefert werden:! 100 % Ethanol! Sterile 1.5 ml Zentrifugenröhrchen (farblos)! Steriles dh 2O (optional)! evtl. 3 M Na-Acetat, ph DNA-Auftrennung DNA-Fragmente durch Agarosegelelektrophorese auftrennen und mittels Ethidiumbromidfärbung sichtbar machen. Für die Gelelektrophorese können alle Arten von Agarosen verwendet werden. Als Laufpuffer sollte vorzugsweise frischer TAE-Puffer verwendet werden, da eine mehrfache Verwendung die Pufferkapazität des Puffers reduziert. Ein in Folge erhöhter ph-wert mindert den Extraktionsertrag. Es kann auch frisch angesetzter TBE-Puffer verwendet werden. Dies bedingt aber in der Regel geringere Erträge. peqgold Gel Extraction Kit Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 4

7 2. Ausschneiden der Bande Gewünschte DNA-Bande nach der Auftrennung mit möglichst wenig überschüssiger Agarose unter UV-Licht ausschneiden. Dazu sollte möglichst langwelliges UV-Licht verwendet werden. Expositionszeiten über 30 Sekunden sollten vermieden werden. Gelstück in ein vorher gewogenes, sauberes 1.5 ml Zentrifugenröhrchen überführen. UV-Licht bewirkt Verbrennungen der Haut und schädigt die Augen. Bei entsprechenden Arbeiten muss deshalb ein Augen- oder besser ein Gesichtsschutz getragen werden. 3. Lösen der Agarose Durch Wiegen des Gelstücks dessen ungefähres Volumen bestimmen. Bei einer anzunehmenden Geldichte von 1 g/ml entspricht ein Gelstück mit einem Gewicht von 0.2 g einem ungefährem Volumen von 0.2 ml. Nach der Volumenbestimmung das gleiche Volumen Binding Buffer zugeben, mischen und für ca. 7 Minuten bei 55 C bis 65 C in einem Wasserbad oder Heizblock inkubieren. Dabei alle 2 3 Minuten schütteln oder vortexen. Sollten nach 7 Minuten noch Reste des Agarosestücks erkennbar sein, muss die Inkubation bis zum vollständigen Lösen der Agarose fortgesetzt werden. Nicht über 65 C erhitzen! Ein zu starkes Erhitzen der Agarose kann zu einer Beeinträchtigung der DNA führen. 4. Überprüfen des ph-wertes Nach dem vollständigen Lösen der Agarose sollte der Binding Buffer eine hellgelbe Farbe aufweisen. Ist die Farbe orange oder rötlich, sind die Zugabe von 5 µl einer 3 M Na- Acetat-Lösung, ph 5.2, und kurzes Mischen erforderlich. Die Farbe sollte anschließend wieder in helles Gelb umschlagen (entsprechend der Farbe des Binding Buffers vor Zugabe und Lösen der Agarose). Die Effizienz der DNA-Bindung an die PerfectBind-Säulenmatrix ist in hohem Maße vom ph-wert abhängig. Ein korrekter ph-wert wird durch die gelbe Farbe des Binding Buffers angezeigt. Liegt der ph bei einem Wert > 7.5 (orange oder rote Farbe des Puffers) ist die vollständige Bindung der DNA an die Matrix nicht gewährleistet. Die Ausbeute kann erheblich beeinträchtigt werden. 5. Laden und Binden Eine PerfectBind DNA Column in ein 2 ml Collection Tube stecken und 750 µl der DNA/Agaroselösung auf die Säule pipettieren. Collection Tube mit Säule für 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss verwerfen. Für Volumina > 750 µl Säule erneut mit maximal 750 µl laden und Zentrifugationsschritt wiederholen. Dabei ist zu beachten, dass die maximale Bindekapazität der Säule bei ca. 30 µg liegt. Bei größeren DNA-Mengen sollte die Probe auf eine geeignete Anzahl von Säulen verteilt werden. peqgold Gel Extraction Kit Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 5

8 6. Waschen I (optional) PerfectBind DNA Column wieder in das geleerte 2 ml Collection Tube stecken und 300 µl Binding Buffer auf die Säule geben. Für 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Dieser Waschschritt dient zur vollständigen Entfernung von Agaroseresten. Er ist insbesondere dann erforderlich, wenn die DNA für sensible Anwendungen wie in vitro Transkription oder Mikroinjektion eingesetzt werden soll. 7. Waschen II 750 µl des komplettierten CG Wash Buffers auf die Säule pipettieren, anschließend für 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss verwerfen und Waschschritt II einmal wiederholen. Optional kann die Säule mit dem CG Wash Buffer vor der Zentrifugation 2 3 Minuten bei RT inkubiert werden. 8. Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!) PerfectBind DNA Column in das geleerte 2 ml Collection Tube stecken und durch einminütiges Zentrifugieren bei x g* vollständig trocknen. 9. Elution PerfectBind DNA Column in ein sauberes 1.5 ml Zentrifugenröhrchen stecken und die DNA mit 30 µl bis 50 µl Elution Buffer eluieren. Dazu die Elutionslösung direkt auf die Mitte der Säulenmatrix pipettieren und für 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Dabei werden 80 % bis 90 % der gebundenen DNA eluiert. Eine optionale zweite Elution verbessert den absoluten Ertrag auf bis zu 95 %, erniedrigt jedoch die Konzentration. Bei Fragmenten > 500 bp werden in der Regel Gesamtausbeuten erreicht, die deutlich über 80 % der eingesetzten DNA liegen. Die Gesamtausbeuten für Fragmente zwischen 50 bp und 500 bp liegen im Normalfall zwischen 55 % und 80 %. Alternativ zur Verwendung des mitgelieferten Elution Buffers ist die Elution auch mit sterilem, deionisiertem Wasser oder TE-Puffer möglich. Es sollte jedoch sichergestellt werden, dass der ph- Wert der verwendeten Lösungen keinesfalls unter ph 8.0 liegt. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 21 peqgold Gel Extraction Kit Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 6

9 B. Extraktion von DNA aus Reaktionsansätzen 1. Agarosegelanalyse des PCR-Ansatzes Den Erfolg und die Qualität der PCR-Amplifikationsreaktion durch Agarosegelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung verifizieren. 2. Laden und Binden Volumen des PCR-Ansatzes bestimmen, mit dem gleichen Volumen Binding Buffer versetzen und anschließend durch Vortexen sorgfältig mischen. Bei PCR-Fragmenten < 200 bp kann durch die Verwendung von bis zu 3 Volumen Binding Buffer ein besseres Ergebnis erzielt werden. Für DNA-Fragmente > 4 kb können 3 Volumen Binding Buffer, gefolgt von 1 Volumen sterilem dh 2O eingesetzt werden, um die Ausbeute zu erhöhen. Eine PerfectBind DNA Column in ein 2 ml Collection Tube stecken und bis zu 750 µl der Mischung aus PCR-Ansatz und Binding Buffer auf die Säule pipettieren. Collection Tube mit Säule für 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss verwerfen und Collection Tube weiterverwenden. Für Volumina > 750 µl Säule erneut mit maximal 750 µl laden und Zentrifugationsschritt wiederholen. Präparation fortsetzen, wie unter Punkt 7 des Protokolls 'Extraktion von DNA aus Agarosegelen' beschrieben * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 21 peqgold Gel Extraction Kit Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 7

10 QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER DNA Um die Konzentration und Reinheit einer DNA-Lösung zu bestimmen, muss die Absorption eines geeignet verdünnten Aliquots (10- bis 50-fach) bei 260 nm und 280 nm gemessen werden. Eine A260-Einheit entspricht dabei 50 µg DNA/ml. Die Konzentration berechnet sich demnach wie folgt: DNA-Konzentration (µg/ml) = Absorption 260 x 50 x Verdünnungsfaktor Das A260/280-Verhältnis ist ein Maß für die Reinheit der isolierten Nukleinsäuren. Die mit dem peqgold Gel Extraction Kit erzielbaren Werte von 1.8 bis 2.0 entsprechen DNA einer Reinheit von 90 % bis 100 %. Alternativ können der ungefähre Ertrag und die Qualität der erhaltenen DNA auch durch Agarosegelelektrophorese mit anschließender Ethidiumbromidfärbung bestimmt werden. DNA-Fragmente, die mit dem peqgold Gelextraction Kits aufgereinigt wurden, können in Elution Buffer oder sterilem, deionisierten Wasser für mehrere Jahre bei 20 C aufbewahrt werden. peqgold Gel Extraction Kit Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 8

11 BESTELLINFORMATIONEN für die DNA-Extraktion aus Gelen und Reaktionsansätzen: peqgold Gel Extraction Kit Reinigungen (Classic-Line) Reinigungen (DNA aus Agarosegelen) Reinigungen peqgold Gel Extraction Kit Reinigungen (Safety-Line) Reinigungen (DNA aus Agarosegelen) Reinigungen peqgold Cycle-Pure Kit Reinigungen (Classic-Line) Reinigungen (DNA aus PCR-Ansätzen) Reinigungen peqgold Cycle-Pure Kit Reinigungen (Safety-Line) Reinigungen (DNA aus PCR-Ansätzen) Reinigungen peqgold MicroSpin Gel Extraction Kit Reinigungen (Safety-Line) Reinigungen (DNA aus Agarosegelen) Reinigungen peqgold MicroSpin Cycle-Pure Kit Reinigungen (Safety-Line) Reinigungen (DNA aus PCR-Ansätzen) Reinigungen peqgold Gel Extraction Kit Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 9

12 TROUBLESHOOTING TIPS Problem Ursache Abhilfe Niedrige DNA- Erträge Säule verstopft Keine DNA im Eluat Zu wenig Binding Buffer zum Gel gegeben. Gelstück nicht vollständig im Binding Buffer gelöst. Ungeeigneter Elutionspuffer. TAE-Laufpuffer war nicht frisch. Unzureichende Elution. Agarose nicht vollständig im Binding Buffer gelöst. CG Wash Buffer- Konzentrat nicht mit absolutem Ethanol verdünnt. Ethanol nach den Waschschritten nicht vollständig von der Säule entfernt. Ungeeigneter Elutionspuffer. Korrekte Bestimmung des Volumens des Agarosegelstücks. Ausreichend Binding Buffer zugeben (bis zu 3 Volumina). Sicherstellen, dass die Temperatur des Wasserbades bzw. Heizblockes 55 C bis 65 C beträgt und Gelstück vollständig schmelzen lassen. Elution wenn möglich mit dem mitgelieferten Elution Buffer durchführen. Falls deionisiertes Wasser oder TE-Puffer verwendet wurden, ph-wert überprüfen (ph > 8.0 erforderlich!). Bei mehrfacher Benutzung verliert TAE-Puffer seine Pufferkapazität und erhält einen steigenden ph- Wert. Dadurch steigt auch der ph-wert der DNA/Agaroselösung, was die DNA-Bindung an der PerfectBind-Matrix beeinträchtigt. Nach Lösen des Agarosestückes Farbe des Binding Buffers prüfen und gegebenenfalls durch Zugabe von 5 µl einer 3 M Na-Acetat-Lösung, ph 5.2, korrigieren. Zur Gelreinigung immer frischen TAE-Puffer verwenden. Elution Buffer in die Mitte der PerfectBind DNA Column geben, 1-2 Minuten einwirken lassen. Evtl. Elution Buffer auf 50 C bis 60 C vorwärmen. Sicherstellen, dass die Wasserbadtemperatur 55 C bis 65 C beträgt und Gelstück vollständig schmelzen. Gelfragmente mit größerem Volumen vor dem Schmelzen in kleinere Stücke zerschneiden. CG Wash Buffer-Konzentrat wie angegeben mit absolutem Ethanol verdünnen. Sicherstellen, dass die Flasche mit dem verdünnten CG Wash Buffer stets dicht verschlossen aufbewahrt wird. Säule vor der Elution trockenzentrifugieren, wie in Schritt 8 angegeben. Elution wenn möglich mit dem mitgelieferten Elution Buffer durchführen. Falls deionisiertes Wasser oder TE-Puffer verwendet wurden, ph-wert überprüfen (ph > 8.0 erforderlich!). peqgold Gel Extraction Kit Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 10

13 Fortsetzung: Problem Ursache Abhilfe Optische Dichte und Ertrag laut Kontrollgel stimmen nicht überein DNA-Probe fließt beim Laden aus der Geltasche Spuren von Kontaminationen erhöhen die Absorption. Ethanol nach den Waschschritten nicht vollständig von der Säule entfernt. Säule zweimal waschen, wie in Schritt 7 angegeben. Optionalen Waschschritt 6 durchführen. Säule vor der Elution trocken zentrifugieren, wie in Schritt 8 angegeben. peqgold Gel Extraction Kit Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 11

14 INTRODUCTION Gel purification of DNA is a common technique for isolation of specific fragments from reaction mixtures. However, most methods either fail to completely remove agarose (which can lead to problems in downstream applications), shear the DNA or result in very low yields. The peqgold Gel Extraction Kit uses PerfectBind technology to recover DNA bands between 50 bp and 40 kb from all grades of agarose gel in yields reaching %. Each PerfectBind DNA Column can bind up to 30 µg DNA. DNA, purified with the peqgold Gel Extraction Kit, is directly suitable for downstream applications like ligations, PCR sequencing, restriction digestion or various labeling reactions. peqgold Gel Extraction Kits are available with Safety-Line or Classic-Line columns (Safety- Line, # xx; Classic-Line, # xx). Safety-Line columns can be closed tightly with snap-on lids to avoid cross-contamination more effectively. Classic-Line columns do not have lids for a more comfortable handling. PRINCIPLE The DNA band of interest is excised from the gel, dissolved in an equivalent volume of Binding Buffer and applied to a PerfectBind DNA Column. DNA will reversibly bind to the silica matrix and, following 2 3 rapid wash steps, where salts, free nucleotides, oligonucleotides and polymerases are removed, the DNA is eluted with deionized water, elution buffer or low salt buffer and ready for further applications. BENEFITS! Speed - DNA recovery from agarose gels in less than 15 min.! Reliability - optimized buffers guarantee pure DNA.! Safety - No organic extractions required.! Quality - purified DNA suitable for any application. peqgold Gel Extraction Kit Order No.: / PEQLAB_v0815_E 12

15 KIT COMPONENTS peqgold Gel Extraction Kit 5 Purifications 50 Purifications 200 Purifications Order No. Safety-Line Order No. Classic-Line Components PerfectBind DNA Columns ml Collection Tubes Binding Buffer 3 ml 30 ml 120 ml CG Wash Buffer 5 ml 20 ml 3 x 20 ml Elution Buffer (10 mm Tris-HCl, ph 9.0) 1 ml 10 ml 30 ml Instruction manual STORAGE AND STABILITY All peqgold Gel Extraction Kit components are stable for at least 12 months from the date of purchase when stored at room temperature (22 25 C). Ensure that the bottle of Binding Buffer is tightly capped when not in use. peqgold Gel Extraction Kit Order No.: / PEQLAB_v0815_E 13

16 BEFORE STARTING Briefly examine this booklet and become familiar with each step. Prepare all components and have the necessary materials ready before starting. peqgold Kits are designed to be simple, fast and reliable if all steps are followed diligently.! CG Wash Buffer is concentrated and has to be diluted with absolute ethanol as follows: Add 20 ml 100 % Ethanol to 5 ml CG Wash Buffer Add 80 ml 100 % Ethanol to 20 ml CG Wash Buffer Add 3 x 80 ml 100 % Ethanol to 3 x 20 ml CG Wash Buffer! Store diluted CG Wash Buffer at room temperature.! All steps must be carried out at room temperature.! Included amounts of DNA Binding Buffer are not sufficient for regular isolation of DNA from agarose fragments < 600 µg. The buffer can be ordered separately if required.! Included amounts of CG Wash Buffer are not sufficient for frequently applying the optional washing step for in vitro transcriptions and micro injections. The buffer can be ordered separately if required. DANGEROUS COMPONENTS peqgold Gel Extraction Kits Components Signal word / symbols Dangerous components H and P-statements PerfectBind DNA Columns ml Collection Tubes Binding Buffer DANGER guanidinium thiocyanate %, acetic acid 1-2.5%, polyethylene glycol octylphenol ether 0.3- <1%, CAS: , , H302+H312+H332, H314, H412, P101, P102, P103, P260, P280, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 CG Wash Buffer Elution Buffer (10 mm Tris-HCl, ph 9.0) peqgold Gel Extraction Kit Order No.: / PEQLAB_v0815_E 14

17 H and P statements H302+H312+H332 H314 H412 P101 P102 P103 P260 P280 P303+P361+P353 P305+P351+P338 P405 P501 Descriptions Harmful if swallowed, in contact with skin or if inhaled. Causes severe skin burns and eye damage. Harmful to aquatic life with long lasting effects. If medical advice is needed, have product container or label at hand. Keep out of reach of children. Read label before use. Do not breathe dust/fume/gas/mist/vapours/spray. Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face protection. IF ON SKIN (or hair): Take off immediately all contaminated clothing. Rinse skin with water/shower. IF IN EYES: Rinse cautiously with water for several minuts. Remove contact lenses, if present and easy to do. Continue rinsing. Store locked up. Dispose of contents/container to PEQGOLD GEL EXTRACTION PROTOCOL A. Extraction of DNA from Agarose gels Materials required, but not supplied:! 100 % Ethanol! Sterile deionized water (optional)! Sterile 1.5 ml centrifuge tubes! 3 M Sodium-Acetat if needed, ph DNA Separation Perform agarose gel/ethidium bromide electrophoresis to fractionate DNA fragments. Any type or grade of agarose may be used. It is strongly recommended to use fresh TAE buffer as running buffer. Do not reuse running buffer as its ph will increase and this will reduce yields. Fresh TBE-buffer may also be used, but usually gives lower yields. 2. Excision of DNA Band When adequate separation of bands has occurred, carefully excise the DNA fragment of interest using a UV light box ensuring not to take more agarose gel as necessary. Avoid more than 30 seconds exposure of UV light to the DNA. Transfer the gel slice to a fresh 1.5 ml microcentrifuge tube. Always use protective eye-ware or better a UV shield when working with UV light. peqgold Gel Extraction Kit Order No.: / PEQLAB_v0815_E 15

18 3. Dilution of Agarose Determine the approximate volume of the gel slice by weighing it in the 1.5 ml microfuge tube. Assuming a density of 1 g/ml of gel, the volume of gel is derived as follows: a gel slice of mass 0.2 g will correspond to a volume of 0.2 ml. Add equal volume of Binding Buffer. Incubate the mixture at 55 C 65 C for 7 min or until the gel has completely melted. It could be useful to mix the sample every 2 3 minutes to improve melting. If agarose remains in the sample after 7 minutes, extend melting until complete agarose is dissolved. Be sure not to heat up over 65 C, because this can lead to impairment of the DNA. 4. ph Value Monitor the ph value of the Gel/Binding Buffer mixture after the gel is completely dissolved. DNA yield will be significantly decreased when ph value is > 8.0. If the color of the mixture becomes orange or red, add 5 µl of 3 M sodium acetate (ph 5.2) to bring the ph down. After this adjustment, the color of the gel/binding Buffer mixture should be light yellow (similar to the original Binding Buffer). The binding efficiency of DNA to the silica matrix is strongly dependent on the ph value. The correct ph is shown by a yellow colour of the Binding Buffer after dissolving the agarose slice. If the ph is > 7.5 (orange or red colour) the complete binding of DNA to the silica matrix is no more guaranteed and the final yield can be dramatically reduced. 5. Load and bind Place a fresh PerfectBind DNA Column in a 2 ml Collection Tube and add 750 µl of the DNA/agarose solution. Centrifuge the PerfectBind DNA Column/Collection Tube assembly for 1 min at x g*. Discard the flow-through and keep the Collection Tube for further steps. For volumes higher than 750 µl load the column again and centrifuge successively, 750 µl at a time. Each PerfectBind DNA Column has a total capacity of approx. 30 µg DNA. If the expected yield is higher, divide the sample into an appropriate number of columns. * Translation of g (rcf) / rpm see Appendix, page Wash I (optional) Discard liquid and add 300 µl Binding Buffer to the column. Centrifuge at x g* for 1 min. Discard flow-through liquid and reuse collection tube in the following steps. This wash step improves the complete removal of remaining agarose from the column. It is especially necessary if the DNA needs to be used in sensitive downstream applications like in vitro transcription or microinjection. peqgold Gel Extraction Kit Order No.: / PEQLAB_v0815_E 16

19 7. Wash II Place the PerfectBind DNA Column back in the Collection Tube and add 750 µl of CG Wash Buffer diluted with ethanol. Centrifuge at x g* for 1 min. Discard the flow-through liquid and repeat step 7 with another 750 µl of CG Wash Buffer. Optional: The PerfectBind DNA Column can be incubated with the CG Wash Buffer for 2 3 minutes at room temperature before centrifugation. 8. Dry (Important! Do not skip this step!) Place the PerfectBind DNA Column containing your DNA in the Collection Tube used in step 7 and centrifuge for 1 min at x g* to dry the column matrix. This step is essential to completely remove ethanol from the column. 9. Elution Place the PerfectBind DNA Column into a fresh 1.5 ml microcentrifuge tube. Add µl Elution Buffer (depending on the desired final concentration of DNA) directly to the binding matrix in the PerfectBind DNA Column and centrifuge for 1 min at x g* to elute DNA. This first elution represents approximately % of the bound DNA. An optional second elution will improve yield up to 95 %, though at a lower concentration. For fragments > 500 bp you usually get more than 80 % yield. For fragments of 50 bp 500 bp you usually get 55 % 80 %. * Translation of g (rcf) / rpm see Appendix, page 21 peqgold Gel Extraction Kit Order No.: / PEQLAB_v0815_E 17

20 B. Extraction of DNA from PCR reaction 1. Agarose gel electrophoresis Perform agarose gel/ethidium bromide electrophoresis to verify success of the PCR reaction. 2. Load and Bind Transfer PCR reaction to a clean 1.5 ml microfuge tube, add an equivalent volume of Binding Buffer and vortex thoroughly. For PCR products < 200 bp add up to 3 volumes of Binding Buffer; for fragments > 4 kb add 3 volumes Binding Buffer, followed by 1 volume aqua bidest. Apply the sample to an PerfectBind DNA Column assembled in a clean 2 ml Collection Tube (provided) and centrifuge in a microcentrifuge at x g* for 1 min. Discard the liquid and reuse collection tubes in the following steps. Continue the preparation as described under step 7 of protocol 'Extraction of DNA from Agrose gels'. YIELD AND QUALITIY OF DNA Determine the absorption of an appropriate dilution (20- to 50-fold) of the sample at 260 nm and 280 nm. One A 260-unit corresponds to 50 µg DNA/ml. The DNA concentration is calculated as follows: DNA conc. (µg/ml) = Absorption Dilution Factor The ratio of A 260/280 is an indicator for nucleic acid purity. A value indicates a purity of 90 % 100 %. Alternatively, quantity (as well as quality) can sometimes best be determined by agarose gel/ethidium bromide electrophoresis by comparison to DNA samples of known concentrations. DNA purified with the peqgold Gel Extraction Kit can be stored in Elution Buffer or sterile, deionized water at 20 C for years. * Translation of g (rcf) / rpm see Appendix, page 21 peqgold Gel Extraction Kit Order No.: / PEQLAB_v0815_E 18

21 ORDERING INFORMATION For DNA from agarose gels and PCR reactions: peqgold Gel Extraction Kit Preparations (Classic-Line) Preparations (DNA from agarose gels) Preparations peqgold Gel Extraction Kit Preparations (Safety-Line) Preparations (DNA from agarose gels) Preparations peqgold Cycle-Pure Kit Preparations (Classic-Line) Preparations (DNA from PCR reactions) Preparations peqgold Cycle-Pure Kit Preparations (Safety-Line) Preparations (DNA from PCR reactions) Preparations peqgold MicroSpin Gel Extraction Kit Preparations (Safety-Line) Preparations (DNA from agarose gels) Preparations peqgold MicroSpin Cycle-Pure Kit Preparations (Safety-Line) Preparations (DNA from PCR reactions) Preparations peqgold Gel Extraction Kit Order No.: / PEQLAB_v0815_E 19

22 TROUBLESHOOTING TIPS Problem Likely cause Suggestion Low DNA yields Too little Binding Buffer added to gel. Agarose gel not completely dissolved in Binding Buffer. TAE running buffer was not fresh. Inappropriate elution buffer. Volume of agarose gel slice was determined incorrectly. Add enough Binding Buffer as instructed in the manual (up to 3 volumes). Make sure water bath is set to 55 C to 65 C and allow gel to melt completely. With overuse, TAE loses its buffering capacity. This raises the ph of the agarose/ DNA/ Binding Buffer solution which interferes with DNA binding to PerfectBind matrix. After complete dissolving of the agarose, check ph of the sample and correct it with 3 M NaAc, ph 5.2 if necessary. It is always recommended to use fresh TAE buffer. Check ph of water or use 10 mm Tris-HCl (ph 9.0) included in this kit to elute DNA. Column clogged No DNA eluted Optical densities do not agree with DNA yield on agarose gel. DNA floats out of well while loading agarose gel Uncompleted elution. Agarose gel not completely dissolved in Binding Buffer. CG Wash Buffer concentrate not diluted with absolute ethanol. Ethanol not completely removed from column. Inappropriate elution buffer. Trace contaminants eluted from column increase A 260. Ethanol not completely removed from column following wash steps. Be sure to pipette Elution Buffer directly in the middle of the PerfectBind matrix. To improve elution, incubate column at RT for 1-2 min. Elution could also be improved by prewarming Elution Buffer up to 50 C 60 C. Make sure water bath is set to 55 o C to 65 o C and allow gel to melt completely. For large agarose slices (> 0.3 ml) it is recommended that the gel is diced into smaller fragments to improve melting. Prepare CG Wash Buffer concentrate with 100 % ethanol as instructed in the manual. Take care to keep CG Wash Buffer tightly closed between each use. Centrifuge as instructed in step 8 of the protocol. Check ph of water or use the Elution Buffer included in this kit to elute DNA. Make sure to wash column as instructed in step 7 and perform optional wash step 6. Alternatively, rely on agarose gel/ethidium bromide electrophoresis for quantitation. Centrifuge column as instructed in step 8 to dry completely. peqgold Gel Extraction Kit Order No.: / PEQLAB_v0815_E 20

23 APPENDIX 1: Umrechnungstabelle rcf/rpm. Werte für Zentrifugen, abhängig vom Rotordurchmesser. Fig. 1: Table rcf/rpm. Values for centrifuges depending on rotor diameter. Abb. peqgold Gel Extraction Kit Order No.: / PEQLAB_v0815_E 21

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