Precellys Tissue RNA Kit

Transkript

1 Arbeitsanleitung - Instruction Manual Precellys Tissue RNA Kit (Safety-Line) V0815

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3 INHALT EINLEITUNG 1 FUNKTIONSPRINZIP 1 KITBESTANDTEILE 2 LAGERUNG 2 BINDEKAPAZITÄT 2 WICHTIGE HINWEISE 3 Einmalige Vorbereitung des Waschpuffers 3 Benötigte Materialien, die nicht mitgeliefert werden: 3 GEFÄHRLICHE INHALTSSTOFFE 4 PRECELLYS TISSUE RNA KIT ISOLIERUNGSPROTOKOLL 6 AUFKONZENTRIERUNG DER RNA 8 QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER RNA 8 TROUBLE SHOOTING TIPPS 9 CONTENT INTRODUCTION 1 PRINCIPLE 1 KIT COMPONENTS 2 STORAGE AND STABILITY 2 BINDING CAPACITY 2 BEFORE STARTING 3 Initial preparation of Wash buffer 3 Required equipment and materials to be supplied by the user 3 DANGEROUS COMPONENTS 4 PRECELLYS TISSUE RNA KIT PROTOCOL 6 CONCENTRATING THE RNA 8 QUANTIFICATION AND STORAGE OF THE RNA 8 TROUBLESHOOTING 9 PEQLAB_v0815_D+E

4 EINLEITUNG Die Precellys Tissue RNA Kits bieten eine schnelle und einfache Methode, um bis zu 100 µg Gesamt-RNA aus unterschiedlichen tierischen Geweben zu isolieren. Mit geringem Arbeitsaufwand gestatten sie die Bearbeitung einzelner oder zahlreicher Proben, wobei je Präparation bis zu 20 mg Gewebe eingesetzt werden kann. Das Kit wurde speziell für die Verwendung des Homogenisators Precellys 24 zur schnellen, effektiven und reproduzierbaren Homogenisierung und zum Zellaufschluss von zahlreichen, insbesondere auch widerstandsfähigen Geweben entwickelt. Im Precellys Tissue RNA Kit enthalten sind 2 ml Schraubdeckelgefäße, gefüllt mit einer optimierten Menge an Aufschlussbeads aus Keramik mit einem Durchmesser von 1.4 mm und 2.8 mm zur effektiven Zelllyse von tierischem Gewebe. Mit den Precellys Tissue RNA Kits können mehrere Isolierungen parallel in weniger als 60 min durchgeführt werden. Extraktionen mit organischen Lösungsmitteln, wie Phenol oder Chloroform, müssen ebenso wenig durchgeführt werden wie zeitaufwändige Fällungen mit Isopropanol oder Ethanol. Zelluläre RNA, die mit den Precellys Tissue RNA Kits isoliert wurde, kann direkt für alle Arten von Folgeexperimenten, wie RT-PCR, Northern Blotting, poly(a) + -RNA (mrna) Isolierung, Nuclease Protection Assays und In-vitro Translation weiterverwendet werden. Precellys Tissue RNA Kits enthalten Safety-Line Säulen zur Isolierung hochreiner RNA. Schnappdeckel sorgen bei den Safety-Line Säulen für einen sicheren Verschluss und zusätzlichen Schutz vor Kreuzkontaminationen. FUNKTIONSPRINZIP Die Precellys Tissue RNA Kits kombinieren die selektiven und reversiblen Bindungseigenschaften von PerfectBind -Silikamembranen mit der Schnelligkeit und leichten Durchführbarkeit von Zentrifugationssäulenmethoden. Ein speziell entwickeltes und optimiertes Puffersystem erlaubt die Reinigung von bis zu 100 µg Gesamt-RNA mit Moleküllängen größer als 200 bp. Die aufzuarbeitenden Proben werden im Homogenisator Precellys 24 homogenisiert und unter denaturierenden und auf das Probenmaterial abgestimmten Bedingungen lysiert. Anschließend werden sie auf eine DNA Removing Säule geladen, in der DNA-Moleküle selektiv an die enthaltene Silikamembran binden. In einem zweiten Bindungsschritt wird RNA effektiv an die Silikamembran einer PerfectBind -RNA-Säule gebunden. Zellulärer Debris, Proteine und sonstige Kontaminationen können hier durch Waschen mit speziellen Puffern schnell und einfach entfernt werden. Die gereinigte und qualitativ sehr hochwertige RNA wird abschließend in RNase-freiem Wasser eluiert. PEQLAB_v0815_D 1

5 KITBESTANDTEILE Precellys Tissue RNA Kit 5 Reinigungen 50 Reinigungen Best.-Nr. Safety-Line Bestandteile Precellys Ceramic Kit 1.4/2.8 mm 5 50 DNA Removing Columns 5 50 PerfectBind RNA Columns ml Collection Tubes RNA Lysis Buffer T-P 2 x 1.5 ml 25 ml RNA Wash Buffer I 5 ml 50 ml RNA Wash Buffer II 2.0 ml 16 ml RNase-free Water 1 ml 5 ml Arbeitsanleitung 1 1 LAGERUNG Alle Komponenten des Kits sollten bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. Bei einer Umgebungstemperatur von C bleiben die Komponenten des Kits für mindestens 12 Monate ab Lieferung stabil. BINDEKAPAZITÄT Die Bindekapazität der PerfectBind RNA Columns beträgt rund 100 µg RNA mit Moleküllängen größer als 200 bp. Es sollte nicht mehr als die angegebene Menge an Ausgangsmaterial eingesetzt werden. PEQLAB_v0815_D 2

6 WICHTIGE HINWEISE Bitte lesen Sie das vorliegende Protokoll vor der ersten Verwendung des Kit vollständig durch und legen Sie vor Präparationsbeginn alle für die Isolierung benötigten Materialien bereit. Einmalige Vorbereitung des Waschpuffers! RNA Wash Buffer II wird als Konzentrat geliefert und muss vor seiner ersten Verwendung mit absolutem Ethanol verdünnt werden: 5 Reinigungen 2 ml RNA Wash Buffer II mit 8 ml 100 % EtOH mischen. 50 Reinigungen 16 ml RNA Wash Buffer II mit 64 ml 100 % EtOH mischen. Verdünnter RNA Wash Buffer II sollte bei Raumtemperatur gelagert oder vor seiner Verwendung auf Raumtemperatur gebracht werden. RNA Wash Buffer II sollte nach der Verwendung gut verschlossen werden.! Alle Zentrifugationsschritte sollten bei C durchgeführt werden. Benötigte Materialien, die nicht mitgeliefert werden:! Precellys 24 Homogenisator! Tischzentrifuge für 2 ml Reaktionsgefäße! 100 % Ethanol! 70 % Ethanol! Sterile Pipettenspitzen und Reaktionsgefäße PEQLAB_v0815_D 3

7 GEFÄHRLICHE INHALTSSTOFFE Precellys Tissue RNA Kit Bestandteile Precellys Ceramic Kit 1.4/2.8 mm Signalwort / Symbole DNA Removing Columns - PerfectBind RNA Columns - 2 ml Collection Tubes - RNA Lysis Buffer T-P RNA Wash Buffer I - DANGER DANGER RNA Wash Buffer II - RNase-free Water - Gefährliche Inhaltsstoffe H- und P-Sätze Guanidinthiocyanat %, CAS: Ethanol 25-50%, guanidinium thiocyanate 10-<25%, CAS: , H302+H312+H332, H314, H412, P101, P102, P103, P260, P280, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 H225, H314, P101, P102, P103, P210, P241, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P PEQLAB_v0815_D 4

8 H- und P-Sätze Erläuterungen H225 Flüssigkeit und Dampf leicht entzündbar. H302+H312+H332 Gesundheitsschädlich bei Verschlucken, Hautkontakt oder Einatmen. H314 H412 Verursacht schwere Verätzungen der Haut und schwere Augenschäden. Schädlich für Wasserorganismen, mit langfristiger Wirkung. P101 P102 P103 P210 P241 P260 P280 P303+P361+P353 P305+P351+P338 P405 P501 Ist ärztlicher Rat erforderlich, Verpackung oder Kennzeichnungsetikett bereithalten. Darf nicht in die Hände von Kindern gelangen. Vor Gebrauch Kennzeichnungsetikett lesen. Von Hitze, heissen Oberflächen, Funken, offenen Flammen sowie anderen Zündquellenarten fernhalten. Nicht rauchen. Explosionsgeschützte elektrische Geräte/Lüftungsanlagen/ Beleuchtungsanlagen/... verwenden. Staub/Rauch/Gas/Nebel/Dampf/Aerosol nicht einatmen. Schutzhandschuhe/Schutzkleidung/Augenschutz/Gesichtsschut z tragen. BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT (oder dem Haar): Alle kontaminierten Kleidungsstücke sofort ausziehen. Haut mit Wasser abwaschen/duschen. BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser ausspülen. Eventuell vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter ausspülen. Unter Verschluss aufbewahren. Inhalt/Behälter zuführen. PEQLAB_v0815_D 5

9 PRECELLYS TISSUE RNA KIT ISOLIERUNGSPROTOKOLL 1. Homogenisierung und Lyse Bis zu 20 mg Gewebe (evtl. hartes Gewebe in Stücke schneiden) in ein Lysegefäß des Precellys Ceramic Kit 1.4/2.8 mm überführen und 100 µl RNA Lysis Buffer T-P zugeben. Lysegefäß in den Probenhalter des Precellys 24 stellen und für 1 x 10 s bei 5000 rpm (weiches Gewebe, z.b Leber) oder 3 x 30 s bei 6500 rpm mit 20 s Pause (hartes Gewebe, z.b. Mausschwanz) homogenisieren. Für widerstandsfähige Gewebe kann eine Erhöhung der Homogenisierungsenergie erforderlich sein. Dabei ist zu beachten, dass übermäßiges Homogenisieren zu einer Scherung der RNA führen kann. Andererseits können bereits hohe Nukleinsäuremengen isoliert werden, obwohl die Homogenisierung unvollständig erscheint. Je nach Gewebe muss evtl. durch Vorversuche das ideale Homogenisierungsprotokoll ermittelt werden. 350 µl RNA Lysis Buffer T-P zugeben, durch Vortexen für 5 s sorgfältig mischen und für 15 min bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln inkubieren. Wenn kein Gerät zum Schütteln verfügbar sein sollte, kann der Ansatz durch 3-4 maliges kurzes Vortexen gemischt werden. Eine DNA Removing Column in ein 2 ml Collection Tube stecken und den Ansatz auf die Säule laden. Für 2 min bei x g zentrifugieren, danach die DNA Removing Column verwerfen und mit dem Filtrat weiterarbeiten. 2. Laden und Binden Ein äquivalentes Volumen 70 % Ethanol zum Filtrat geben und durch Auf- und Abziehen mittels Pipette sorgfältig mischen. Eine PerfectBind -RNA Column in ein 2 ml Collection Tube stecken und bis zu 750 µl des Ansatzes auf die Säule laden. Für 2 min bei x g zentrifugieren, danach den Säulendurchfluss verwerfen und das Collection Tube weiterverwenden. Bei Ansätzen > 750 µl die Säule mehrmals beladen. Auch wenn die Probe noch nicht vollständig über die Säule zentrifugiert worden ist, sollte der Zentrifugationsschritt wiederholt werden. 3. Waschen I 500 µl RNA Wash Buffer I zugeben und für 1 min bei x g zentrifugieren. Den Säulendurchfluss verwerfen und das Collection Tube weiterverwenden. 4. DNase I Verdau (optional) Da durch die PerfectBind RNA-Technologie die vorhandene DNA größtenteils entfernt wird, ist ein zusätzlicher DNase-Verdau für die meisten Folgeanwendungen nicht erforderlich. Dennoch kann es bei einigen sensitiven RNA-Anwendungen nötig sein, die verbliebene DNA durch DNase- Behandlung zu entfernen. Das folgende Protokoll beschreibt den DNase I-Verdau direkt auf der PerfectBind RNA Column (Bestellnr.: /02). PEQLAB_v0815_D 6

10 a. Für jede PerfectBind RNA Column folgenden DNase I Reaktionsmix vorbereiten: DNase I Digestion Buffer 73.5 µl RNase-freie DNase I (20 Kunitz units/µl) 1.5 µl Gesamtvolumen 75 µl Hinweis: 1. DNase I ist sehr empfindlich gegenüber physikalischer Denaturierung, deshalb DNase I- Lösung niemals vortexen! Ein Invertieren des Tubes reicht zum Mischen aus. Den DNase I Reaktionsmix immer direkt vor der RNA-Isolation ansetzen. 2. Der DNase I Digestion Buffer ist im RNase-freien DNase I Digest Kit enthalten. Standard DNase Puffer sind nicht für den "on-membrane" Verdau geeignet! b. 75 µl des DNase I Reakionsmixes direkt auf die Membran der PerfectBind RNA Column pipettieren. Der DNase I Verdau kann nicht vollständig ablaufen, wenn ein Teil des Reaktionsmixes an der Wand oder dem O-Ring der Säule haftet. c. Säule bei Raumtemperatur (25-30 C) für 15 Minuten inkubieren. d. Säule in ein neues 2 ml Collection Tube stecken und 400 µl RNA Wash Buffer I zugeben. Säule bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubieren. Anschließend bei x g für 5 Minuten zentrifugieren und Durchfluss verwerfen. Collection Tube im nächsten Schritt (Schritt 5) weiterverwenden. 5. Waschen II Säule in das geleerte 2 ml Collection Tube stecken und 650 µl RNA Wash Buffer II (mit Ethanol versetzt!) zugeben. Für 1 min bei x g zentrifugieren. Den Säulendurchfluss verwerfen und das Collection Tube weiterverwenden. 6. Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!) Säule in das geleerte 2 ml Collection Tube stecken und durch Zentrifugieren für 2 Minuten bei x g vollständig trocknen. 7. Elution Säule in ein steriles 1.5 ml Reaktionsgefäß überführen und µl RNase-freies Wasser auf die Säulenmatrix pipettieren. Säule im Reaktionsgefäß für 3 Minute bei Raumtemperatur inkubieren und danach für 1 Minute bei 6000 x g zentrifugieren. Säule verwerfen und isolierte RNA bei 70 C lagern. PEQLAB_v0815_D 7

11 AUFKONZENTRIERUNG DER RNA Gesamt-RNA, die mit dem Precellys Tissue RNA Kit aufgereinigt wurde, kann bei Bedarf noch weiter konzentriert werden. Hierzu zunächst NaCl bis zu einer Endkonzentration von 0.1 M und danach 2 Volumen absolutes Ethanol zugeben. Ansatz durch Vortexen sorgfältig mischen und für 10 Minuten bei 20 C inkubieren. Danach für 15 Minuten bei x g zentrifugieren und Überstand verwerfen. 700 µl 80 % Ethanol zugeben und für 2 Minuten bei x g zentrifugieren. Überstand verwerfen, Pellet für 2 Minuten lufttrocknen und RNA in 20 µl RNasefreiem Wasser lösen. QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER RNA Um die Konzentration und Reinheit einer RNA-Lösung zu bestimmen, muss die Absorption eines geeignet verdünnten Aliquots (10- bis 50-fach) bei 260 nm und 280 nm gemessen werden. Eine A 260-Einheit entspricht dabei 40 µg RNA/ml. Die Konzentration berechnet sich demnach wie folgt: RNA-Konzentration (µg/ml) = Absorption 260 x 40 x Verdünnungsfaktor Das A 260/280-Verhältnis reiner Nukleinsäuren liegt bei 2.0. Das mit den Precellys Tissue RNA Kit erzielbare Verhältnis von 1.7 bis 2.0 entspricht deshalb Gesamt- RNA mit einer Reinheit von 85 % bis 100 %. Alternativ können der ungefähre Ertrag und die Qualität der erhaltenen RNA auch durch Agarosegelelektrophorese mit anschließender Ethidiumbromidfärbung und Vergleich mit bekannten RNA-Proben bestimmt werden. Gesamt-RNA, die mit den Precellys Tissue RNA Kit aufgereinigt wurde, kann in RNase-freiem Wasser für mehrere Jahre bei 70 C aufbewahrt werden. Dabei ist zu beachten, dass häufiges Auftauen und Einfrieren zum Scheren der RNA und damit zu einer sukzessiven Reduktion der Molekülgrößen führt. PEQLAB_v0815_D 8

12 TROUBLE SHOOTING TIPPS Problem Ursache Abhilfe Säule verstopft Unvollständige Lyse Inkubationszeit mit RNA Lysis Buffer T-P verlängern und/oder Homogenisierungsenergie erhöhen. Niedriger RNA- Ertrag Degradierte RNA Keine RNA im Eluat DNA Kontamination Schlechtes A 260/280 Verhältnis Probleme mit nachfolgenden Reaktionen Zu große Probenmenge Lysat zu viskos Schlechte Elution Unzureichendes Waschen Zu altes Material Unsachgemäße Bearbeitung Schlechte Bindung der RNA an PerfectBind- RNA-Säule Wash Buffer nicht mit 100 % Ethanol verdünnt. Gemeinsame Aufreinigung von DNA und RNA Säulenmaterial im Eluat vorhanden Verschleppung von Salzen Verschleppung von Ethanol Lysat auf mehrere Precellysröhrchen und PerfectBind-RNA-Säulen verteilen. Lysat mit RNA Lysis Buffer T-P verdünnen und auf mehrere Säulen verteilen. Elution wiederholen oder Elutionsvolumen erhöhen. Säule vor der Elution für 5 Minuten bei 70 C inkubieren oder RNAse-freies Wasser auf 70 C vorheizen. RNA Wash Buffer II wird als Konzentrat geliefert und muss mit 4 Volumen 100 % Ethanol verdünnt werden. Stets frisches, junges Material verwenden. Längere Inkubationen von lysiertem Gewebe ohne vollständiger Zugabe des Lysispuffers sind zu vermeiden. Nach der Isolierung sollte die RNA- Lösung bis zur weiteren Analyse auf Eis gelagert werden. Nach der Zugabe von 70 % Ethanol sofort und sorgfältiger mischen. RNA Wash Buffer II Konzentrat muss mit 4 Volumenteilen absolutem Ethanol verdünnt werden. Mit RNase-free DNase verdauen und bei 37 C für 5 min verdauen. Alternativ kann auch der peqgold DNase I Digest Kit (Kat. No ).verwendet werden Zentrifugationsgeschwindigkeiten höher als die Angegebenen sind unbedingt zu vermeiden. Das Säulenmaterial kann aus der Probe durch Zentrifugation abgetrennt werden, es beeinträchtigt enzymatische Reaktionen nicht. Es ist darauf zu achten, dass der RNA Wash Buffer bei Raumtemperatur gelagert wird und keine Präzipitate enthält. Der Trocknungsschritt mit 2-minütigem Zentrifugieren ist unbedingt einzuhalten. PEQLAB_v0815_D 9

13 INTRODUCTION The Precellys Tissue RNA Kit provides a rapid and convenient method for the isolation of up to 100 µg of total RNA from different animal tissues. The kit allows processing of single or multiple samples simultaneously with up to 20 mg of tissue material or 0.5 cm of mouse or rat tail snips per reaction. The kit is specially developed for use with the homogenizer Precellys 24 for a fast, effective and reproducible homogenization and cell disruption of a wide range of samples including hard to lyse tissues. Provided with the kit are 2 ml screw-cap tubes prefilled with a mixture of optimised amounts of ceramic beads of 1.4 mm and 2.8 mm in diameter giving best results for the lysis of various tissues. The Precellys Tissue RNA Kits are ideal for processing multiple samples in less than 60 min. There is no need for extractions with organic solvents like phenol or chloroform or time consuming steps such as precipitation with isopropyl alcohol or ethanol. RNA purified with the Precellys Tissue RNA Kit is ready for a wide range of applications such as RT-PCR, Northern blotting, poly(a) + -RNA (mrna) purification, nuclease protection assays and in vitro translation. The Precellys Tissue RNA Kit contains PerfectBind spin columns for the isolation of highly purified RNA. The columns can be closed tightly by lids to avoid cross-contamination more effectively. PRINCIPLE The Precellys Tissue RNA Kit uses the reversible binding properties of the PerfectBind matrix, a silicabased material, combined with the speed of mini-column spin technology. A specifically formulated buffer system allows the isolation of up to 100 µg of total RNA with fragment sizes greater than 200 bp to bind to the matrix. Samples are first homogenized with the homogenizer Precellys 24, lysed under appropriate conditions and applied to a DNA Removing Column where DNA binds selectively to the silica membrane. In a second binding step the RNA is effectively bound to the silica membrane of the PerfectBind RNA column. Cellular debris, proteins and other contaminants are washed away by specific buffers. The high quality total RNA is finally eluted in RNase-free water. PEQLAB_v0815_E 1

14 KIT COMPONENTS Precellys Tissue RNA Kit 5 Preparations 50 Preparations Order No. Safety-Line Components Precellys Ceramic Kit 1.4/2.8 mm 5 50 PerfectBind RNA columns 5 50 DNA Removing columns ml Collection Tubes RNA Lysis Buffer T-P 2 x 1.5 ml 25 ml RNA Wash Buffer I 5 ml 50 ml RNA Wash Buffer II 2 ml 16 ml RNase-free water 1 ml 5 ml Instruction manual 1 1 STORAGE AND STABILITY All components of the Precellys Tissue RNA Kit should be stored at room temperature. The components of the kit remain stable at an ambient temperature of C for at least 12 months after the date of purchase. BINDING CAPACITY Each PerfectBind column can bind more than 100 µg of RNA molecules greater than 200 bases. Using more than 20 mg of tissue is not recommended. PEQLAB_v0815_E 2

15 BEFORE STARTING Please read the protocol carefully before the first use of the Precellys Tissue RNA Kit and keep all required materials available before starting the preparation. Initial preparation of Wash buffer! RNA Wash Buffer II is delivered as a concentrate and must be diluted with absolute ethanol before use: 5 Preparations Mix 2 ml RNA Wash buffer II with 8 ml 100 % EtOH. 50 Preparations Mix 16 ml RNA Wash buffer II with 64 ml 100 % EtOH. Diluted RNA Wash Buffer II should be stored at room temperature. If stored at lower temperatures, it should be heated to room temperature before use. RNA Wash Buffer II should be closed firmly when not in use.! All centrifugation steps have to be performed at C. Required equipment and materials to be supplied by the user! Precellys 24 homogenizer! Microcentrifuge for 2 ml tubes! 100 % ethanol! 70 % ethanol! Sterile pipette tips and centrifuge tubes PEQLAB_v0815_E 3

16 DANGEROUS COMPONENTS Precellys Tissue RNA Kit Components Precellys Ceramic Kit 1.4/2.8 mm Signal word / symbols DNA Removing Columns - PerfectBind RNA Columns - 2 ml Collection Tubes - RNA Lysis Buffer T-P RNA Wash Buffer I - DANGER DANGER RNA Wash Buffer II - RNase-free Water - Dangerous components H and P statements Guanidinthiocyanat %, CAS: Ethanol 25-50%, guanidinium thiocyanate 10-<25%, CAS: , H302+H312+H332, H314, H412, P101, P102, P103, P260, P280, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 H225, H314, P101, P102, P103, P210, P241, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P PEQLAB_v0815_E 4

17 H and P statements H225 H302+H312+H332 H314 H412 P101 P102 P103 P210 P241 P260 P280 P303+P361+P353 P305+P351+P338 P405 P501 Descriptions Highly flammable liquid and vapour. Harmful if swallowed, in contact with skin or if inhaled. Causes severe skin burns and eye damage. Harmful to aquatic life with long lasting effects. If medical advice is needed, have product container or label at hand. Keep out of reach of children. Read label before use. Keep away from heat, hot surfaces, sparks, open flames and other ignition sources. No smoking. Use explosion-proof electrical/ventilating/lighting/ / equipment. Do not breathe dust/fume/gas/mist/vapours/spray. Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face protection. IF ON SKIN (or hair): Take off immediately all contaminated clothing. Rinse skin with water/shower. IF IN EYES: Rinse cautiously with water for several minuts. Remove contact lenses, if present and easy to do. Continue rinsing. Store locked up. Dispose of contents/container to PEQLAB_v0815_E 5

18 PRECELLYS TISSUE RNA KIT PROTOCOL 1. Homogenization and lysis of tissue material Transfer up to 20 mg of tissue material (cut hard to lyse tissue in pieces) into a tube of the Precellys Ceramic Kit 1.4/2.8 mm and add 100 µl of RNA Lysis Buffer T-P. Place the tube in the tube holder of the Precellys 24 and homogenize 1 x 10 s at 5000 rpm (soft tissue, e.g. liver) or 3 x 30 s at 6500 rpm with 20 s pause (hard tissue, e.g. mouse tail) For hard to lyse tissues an increase of homogenization energy might be necessary. Note that excessive homogenization can lead to shearing of the RNA. Depending on the tissue the homogenization protocol has to be optimized by preliminary experiments. Open the tube and add 350 µl RNA Lysis Buffer T-P. Incubate for 15 min at room temperature while shaking. If a shaking device is not available, mix the solutions 3 to 4 times by vortexing shortly. Assemble a DNA Removing Column in a 2 ml collection tube. Transfer the sample onto the DNA Removing Column and centrifuge for 2 min at x g ( rpm in a standard microcentrifuge). Discard the DNA Removing Column and keep the filtrate. 2. Loading and Binding Add an equal volume of 70 % ethanol to the filtrate and mix by pipetting up and down. Assemble a PerfectBind RNA column in a 2 ml collection tube. Transfer up to 750 µl of the sample onto the column and centrifuge for 1 minute at x g. Discard the flow-through liquid and repeat loading the column with the remaining lysate if necessary. Discard the flow-through and keep the collection tube. Repeat centrifugation if the sample has not been centrifuged completely. 3. Washing I Add 500 µl RNA Wash Buffer I to the column and centrifuge for 1 minute at x g. Discard the flow-through and keep the collection tube. 4. DNase I Digestion (optional) Since PerfectBind RNA resin and spin-column technology actually removes most of DNA without the DNase treatment, it is not necessary to do DNase digestion for most downstream applications. However, certain sensitive RNA applications might require further DNA removal. Following steps provide on-membrane DNase I digestion (Order No ). a. For each PerfectBind RNA Column, prepare this DNase I digestion reaction mix: DNase I Digestion Buffer 73.5 µl RNase-free DNase I (20 Kunitz units/µl) 1.5 µl Total volume 75 µl PEQLAB_v0815_E 6

19 Note: 1. DNase I is very sensitive for physical denaturation, so do not vortex this DNase I mixture! Mix gently by inverting the tube. Prepare the fresh DNase I digestion mixture directly before RNA isolation. 2. DNase I Digestion Buffer is supplied with RNase-free DNase set. Standard DNase buffers are not compatible with on-membrane DNase digestion! b. Pipet 75 µl of the DNase I digestion reaction mix directly onto the surface of PerfectBind RNA resin in each column. Make sure to pipet the DNase I digestion mixture directly onto the membrane. DNase I digestion will not be complete if some of the mix stick to the wall or the O- ring of the PerfectBind RNA Column. c. Incubate at room temperature (25-30 C) for 15 minutes. d. Place a PerfectBind RNA Column into a new 2 ml Collection Tube and add 400 µl RNA Wash Buffer I. Place the column at benchtop for 5 minutes. Centrifuge at x g for 5 minutes and discard flow-through. Re-use Collection Tube in the next step. Continue with step Washing II Place the column in the empty 2 ml collection tube and add 650 µl of the RNA Wash Buffer II (completed with ethanol!) on the column. Centrifuge the column with the collection tube for 1 minute at x g. Discard the flow-through and keep the collection tube. Repeat this wash step using the same collection tube and discard the flow-through liquid. 6. Drying (Important step! Do not reduce centrifugation time!) Place the column in the empty collection tube and dry the column completely by centrifugation for 2 minutes at x g. 7. Elution Place the column into a sterile 1.5 ml microfuge tube and add µl RNase-free water. Incubate tubes for 3 min at room temperature before centrifugation. To elute RNA from the column, centrifuge for 1 min at 6000 x g. Discard the PerfectBind RNA column. Isolated RNA should be stored at 70 C. PEQLAB_v0815_E 7

20 CONCENTRATING THE RNA Total cellular RNA purified with the Precellys Tissue RNA Kit can be further concentrated if required. Add NaCl to an end concentration of 0.1 M and 2 sample volumes of absolute ethanol. Mix thoroughly by vortexing and incubate for 10 minutes at 20 C. Centrifuge for 15 minutes at x g and discard the supernatant. Add 700 µl of 80 % ethanol and centrifuge for 2 minutes at x g. Discard the supernatant, air-dry the pellet for 2 minutes and dissolve the RNA in 20 µl of RNase-free water. QUANTIFICATION AND STORAGE OF THE RNA To determine the concentration and the purity of a RNA containing solution, the absorbance of a 10- to 50-fold diluted aliquot is measured at 260 nm and 280 nm in a spectrophotometer. One A 260 unity corresponds to 40 µg of RNA per ml. The concentration can be determined as follows: RNA concentration (µg/ml) = absorbance 260 x 40 x dilution factor The A 260/280 ratio of pure nucleic acids is 2.0. Generally total RNA isolated with the Precellys Tissue RNA Kit shows ratios between 1.7 and 2.0 corresponding to a purity of 85 % to 100 %. Total RNA isolated with the Precellys Tissue RNA Kit can be stored in RNase-free water for several years at 70 C. Avoid frequent freezing and thawing as this can lead to RNA degradation. PEQLAB_v0815_E 8

21 TROUBLESHOOTING Problem Possible Cause Suggestions Clogged column Incomplete lysis Sample too large Sample too viscous Low RNA yield Incomplete lysis See above. Poor elution Improper washing Clogged column Optimise homogenization parameter or extend incubation time of lysis with RNA Lysis Buffer T-P. Divide the sample into several Precellys tubes to homogenize. Distribute lysate on more than one column. Dilute lysate with RNA Lysis Buffer T-P. Distribute lysate on more than one column. Pipette RNase-free water onto the center of silica membrane. Repeat elution or increase elution volume. Incubate column at 70 C for 5 minutes with RNase-free water before centrifugation or pre-heat the RNase-free water to 70 C. Wash Buffer concentrate must be diluted with ethanol before first use. See above. Degraded RNA Old material Use fresh and young tissue material or cells growing in log phase. No RNA eluted Low A 260/280 ratio DNA contamination Problems with downstream applications Improper handling Poor binding of RNA to the PerfectBind column No ethanol added to Wash Buffer concentrate Resin from the column present in the eluate Co-purification of DNA Salt carry-over Ethanol carry-over Avoid longer incubation at room temperature before adding the full volume of lysis buffer. Keep on ice after the isolation procedure until further analysis. Mix sample thoroughly with 70 % EtOH prior to loading onto PerfectBind column. Dilute Wash Buffer with the indicated volume of absolute ethanol before first use. Avoid centrifugation at speeds higher than specified. The material can be removed from the eluate by centrifugation and will not interfere with enzymatic reactions. Digest with RNase-free DNase and incubate at 37 o C for 5 min. Alternatively use the peqgold DNase I Digest Kit (Cat. No ). Ensure that the RNA Wash Buffer is at room temperature and does not contain any precipitates. Dry the columns after the washing step for at least 2 minutes by centrifugation at maximum speed. PEQLAB_v0815_E 9

22 NOTES PEQLAB_v0815_E 10

23 NOTES PEQLAB_v0815_E 11

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