SCRIPTUM HIGH PRECISE

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1 Nur für Forschungszwecke Datenblatt Artikel BS = 20 Reaktionen x 50 µl Artikel BS = 100 Reaktionen x 50 µl Artikel BS = 500 Reaktionen x 50 µl Haltbarkeit: 12 Monate Lagerung bei -20 C. Bitte vermeiden Sie häufiges Auftauen und Einfrieren. Inhalt B&S Enzym Mix (roter Deckel) Mix aus SCRIPTUM HIGH PRESICE Reverse Transcriptase, Hot Start High Fidelity Polymerase und RNase-Inhibitor in Lagerungspuffer mit 50% Glycerin (v/v). B&S Reaction Mix (grüner Deckel) 2x konz. Reaktionspuffer inkl. dntps RNase-freies Wasser (weißer Deckel) Beschreibung Der B&S Precise One-Step RT-PCR Kit ist die ideale Wahl für alle Anwendungen, bei denen es auf die Durchführung von hoch sensitiver reverser Transkription und anschließender PCR mit hoher Amplifikationsgeschwindigkeit in einem einzigen Reaktionsgefäß ankommt. Der Enzym-Mix enthält eine gentechnisch optimierte reverse Transkriptase mit verbesserter thermischer Stabilität. Dadurch wird eine höhere Spezifität, größere cdna Ausbeute und eine verbesserte Transkriptionseffizienz auch bei längeren cdna Stücken mit ausgeprägter Sekundärstrukturbildung erreicht. Weiterhin enthält der Enzym-Mix eine rekombinante Polymerase mit Proof-reading Aktivität, die im Vergleich zu einer herkömmlichen Taq-Polymerase mit 50-fach höherer Genauigkeit und erhöhter Prozessivität die Elongationszeiten halbiert. Seite 1

2 Der Kit enthält alle für eine RT-PCR benötigten Reagenzien (außer Template und Primer) in einer Verpackungseinheit für eine schnelle und einfache Vorbereitung mit einem Minimium an Pipettierschritten. Der Enzym-Mix in Premiumqualität und der optimierte Reaktionspuffer mit ultrareinen dntps garantieren herausragende Amplifikationsergebnisse. Bei der RT-PCR wird ausgehend von einzelsträngigen RNA-Molekülen doppelsträngige DNA synthetisiert. Im ersten Schritt, der reversen Transkription, generiert die Reverse Transkriptase einzelsträngige DNA Moleküle (cdna) komplementär zu den in der Probe vorhandenen RNA templates. Im ersten Zyklus der PCR synthetisiert die DNA- Polymerase DNA-Moleküle komplementär zur einzelsträngigen cdna und generiert so doppelsträngige DNA-Moleküle. In den folgenden PCR-Zyklen werden die gewonnenen doppelsträngigen DNA-Moleküle exponentiell vervielfältigt. In Ein-Schritt RT-PCR Reaktionen sind alle benötigten Komponenten sowohl für die reverse Transkription als auch für die PCR im Reaktionsgefäß bereits vor Reaktionsstart enthalten und beide Reaktionsschritte werden so direkt nacheinander durchgeführt ohne dass das Reaktionsgefäß noch einmal geöffnet werden muß. Dies bietet eine große Arbeitserleichterung wenn die gleiche Zielsequenz in unterschiedlichen RNA Proben untersucht wird und reduziert das Risiko von Kontaminationen. Sensitivität Zielsequenzen können generell in 1pg bis 20 ng poly(a) RNA (mrna) oder 50 pg to 1µg Gesamt-RNA nachgewiesen werden. Hoch exprimierte Zielsequenzen können eventuell bereits aus geringeren RNA-Mengen erfolgreich amplifiziert werden RT-PCR assay ohne Denaturierung der Proben (standard RNA/primer Kombinationen) 1. Präparation des RT-PCR Assays Bitte beachten: Die Denaturierung der Proben ist besonders empfohlen für RNA Targets, die ein hohes Maß an Sekundärstrukturbildung aufweisen, für selbst- oder kreuzkomplementäre Primer und für erste Experimente mit neuen Targets. Für viele Standardkombinationen aus RNA und Primern kann die Hitzedenaturierung ohne negative Effekte auf das Ergebnis umgangen werden. Die folgenden Komponenten werden in ein Nuklease-freies Reaktionsgefäß pipettiert. Alle Arbeitsschritte sollten auf Eis pipettiert werden und die einzelnen Komponenten durch vorsichtiges Auf- und Ab-pipettierten gemischt werden. Grundsätzlich sollten Wasser, RNA und Primer gemischt werden bevor die anderen Komponenten zugefügt werden. Seite 2

3 Komponente Reaction Mix Konzentration der Stammlösung Endkonzentration 1 assay 2x 1x 25 µl RNA Template 1) 1 pg - 1 µg x µl forward Primer 10 µm nm 1-2 µl reverse Primer 10 µm nm 1-2 µl Enzyme Mix 2) 2 µl RNase-freies Wasser auffüllen auf 50 µl 1) 10 pg bis 200 ng poly(a) RNA oder 100 pg bis 2 µg Gesamt-RNA 2) SCRIPTUM HIGH PRESICE RT-PCR Enzyme Mix enthält bereits einen RNase Inhibitor, welcher empfohlen bzw. essentiell ist wenn mit geringer Ausgangskonzentration an RNA gearbeitet wird. Weiter wie unter Reverse Transkription und PCR-Protokoll beschrieben. RT-PCR assay mit Denaturierung der Proben (RNA/primer mit ausgeprägter Sekundärstrukturbildung) Bitte beachten: Die Denaturierung der Proben ist besonders empfohlen für RNA Targets, die ein hohes Maß an Sekundärstrukturbildung aufweisen, für selbst- oder kreuzkomplementäre Primer und für erste Experimente mit neuen Targets. Für viele Standardkombinationen aus RNA und Primern kann die Hitzedenaturierung ohne negative Effekte auf das Ergebnis umgangen werden. 1. Präparation des RNA / Primer Mix Die folgenden Komponenten werden in ein Nuklease-freies Reaktionsgefäß überführt und durch vorsichtiges Auf- und Ab-pipettierten gemischt. Seite 3

4 Komponente Konzentration der Endkonzentration 1 assay Stammlösung RNA Template 1) 1 pg - 1 µg x µl forward Primer 10 µm nm 1-2 µl reverse Primer 10 µm nm 1-2 µl Rnase-freies Wasser auffüllen auf 10 µl 1) 10 pg bis 200 ng poly(a) RNA oder 100 pg bis 2 µg Gesamt-RNA 2. Denaturierung und Annealing der Primer Der Ansatz wird 5 min bei 70 C und anschließend 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. 3. Präparation des RT-PCR Mix Die folgenden Komponenten werden in ein weiteres Nuklease-freies Reaktionsgefäß überführt und durch vorsichtiges Auf- und Ab-pipettierten gemischt. Komponente Reaction Mix Enzyme Mix 2) Konzentration der Stammlösung Endkonzentration 1 assay 2x 1x 25 µl 2 µl Rnase-freies Wasser Auffüllen auf 40 µl 2) Enzyme Mix enthält bereits einen RNase Inhibitor, welcher empfohlen bzw. essentiell ist wenn mit geringer Ausgangskonzentration an RNA gearbeitet wird. Seite 4

5 4. Vervollständigung des RT-PCR Mix Der 40 µl RT-PCR Mix wird mit dem 10 µl RNA / Primer Mix vermischt um den 50 µl Ansatz zu vervollständigen. Alle Pipettierschritte sollen auf Eis durchgeführt werden und der Ansatz durch vorsichtiges Auf- und Ab-pipettierten gemischt werden. Reverse Transkription und PCR-Protokoll Die Reaktionsgefäße werden in einen Thermocycler gestellt und folgendes Programm gestartet: Reverse Transkription 3) 50 C min 1x Initiale Denaturierung 95 C 5 min 1x 4) Denaturierung 95 C 10 sec x Annealing 5) C 20 sec x Elongation 6) 72 C 30 sec/kb x abschließende Elongation 72 C 2 min 1x 3) Die optimale Zeit hängt von der Länge der cdna ab. Eine Inkubationszeit von 60 min wird für cdna-fragmente mit einer Länge von mehr als 2000 bp empfohlen. Die optimale Temperatur hängt von der Struktur der RNA ab. Für schwierige RNA Templates mit ausgeprägten Sekundärstrukturen kann die Temperatur auf 55 C erhöht werden. Die optimale Reaktionsdauer und Temperatur sollte für jedes RNA Template individuell angepaßt werden. 4) Die verlängerte Initiale Denaturierung von bis zu 5 min wird empfohlen um die Reverse Transkriptase vollständig zu inaktivieren. 5) Die Annealingtemperatur muß entsprechend der Schmelztemperatur der verwendeten Primer gewählt werden. 6) Die Dauer des Elongationsschrittes hängt von der Länge des Amplicons ab. Empfohlen ist eine Dauer von 1 min pro 1000 bp. Für optimale Spezifität und Amplifikation kann eine individuelle Optimierung der empfohlenen Parameter nötig sein. Die optimalen Reaktionszeiten und Temperaturen sollten für jedes einzelne RNA/Primer Paar angepaßt werden. Seite 5

6 Notes: Seite 6