Mikrobiologie 3, Teil 1

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1 Fachrichtung Biologie, Institut für Mikrobiologie, Lehrstuhl für Mikrobielle Diversität Mikrobiologie 3, Teil 1 Dresden, Jan 2013 Sandro Wolf, Marina Totrova

2 Institut für Mikrobiologie Professur für Mikrobielle Diversität Generelle Hinweise - Arbeitsschutz Biologische Arbeitsstoffe werden entsprechend dem von ihnen ausgehenden Infektionsrisiko in vier Risikogruppen eingeteilt: Risikogruppe 1: Biologische Arbeitsstoffe, bei denen es unwahrscheinlich ist, dass sie beim Menschen eine Krankheit verursachen. Bacillus subtilis, Clostridium pasteurianum, Escherichia coli K12, Micrococcus luteus, Mycobacterium phlei Risikogruppe 2: Biologische Arbeitsstoffe, die eine Krankheit beim Menschen hervorrufen können und eine Gefahr für Beschäftigte darstellen können; eine Verbreitung des Stoffes in der Bevölkerung ist unwahrscheinlich; eine wirksame Vorbeugung oder Behandlung ist normalerweise möglich. Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Enterococcus faecalis, Klebsiella oxytoca, Pseudomonas aeruginosa TU Dresden,

3 Fotos: Stadtentwässerung Dresden GmbH

4 Aufbau einer 3-stufigen Kläranlage Vorklärung Biologie/Belebung Nachklärung Überschussschlamm Rücklaufschlamm Zulauf Belebtschlamm Ablauf

5 Institut für Mikrobiologie Professur für Mikrobielle Diversität Kursziele: Gesamtzellzahl mit DAPI Anteil kultivierbarer Mikroorganismen Proteinbestimmung Trockensubstanzgehalt Enzymaktivität in den Proben Molekularbiologische Bestimmung/Quantifizierung von Noroviren TU Dresden,

6 Bestimmung der Gesamtzellzahl mittels DAPI DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol = DNA-Farbstoff lagert sich bevorzugt an AT-reiche Regionen der DNA an. Bei Anregung mit ultraviolettem Licht fluoresziert DAPI im sichtbaren Bereich mit blauer bis cyaner Farbe. In Verbindung mit doppelsträngiger DNA liegt das Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 358 nm, das Emissionsmaxium bei 461 nm.

7 Bestimmung der Gesamtzellzahl mittels DAPI Wie wird es gemacht? Probe homogenisieren und verdünnen entsprechende Probemenge mit DAPI (10 µg/ml Endkonzentration) versetzen nach 30 min Inkubation im Dunkeln Vakuumfiltration Fluoreszenzmikroskopische Auswertung Durchmesser Filter (Filtrieraufsatz): 20 mm A F = π r 2 = 314 mm 2 Kantenlänge Zählfeld 100 µm = 0,1 mm A ZF = 0,01 mm 2 x = filtriertes Probevolumen Zellzahl/ml = M * (A F / A ZF ) * (1 / x ml) Vakuumfiltrationseinheit M = Mittelwert der Zellzahl je Zählfeld (mind. 5 Zählungen, besser > 400 Zellen)

8 Bestimmung des Proteingehaltes Grundlage: - Proteingehalt beträgt ca. 50 % der Trockenmasse - Schwankungen a.g. des physiologischen Zustandes Proteingehalt ist die wichtigste Bezugsgröße für Enzymaktivitäten (Reaktionsgeschwindigkeit bezogen auf den Proteingehalt = spezifische Aktivität)

9 Bestimmung des Proteingehaltes Oliver Howe Lowry ( ) 1. Biuretreaktion: Bildung eines blau-violetten Metall-Komplexes zwischen Peptidbindungen und Cu(II)-Ionen in alkalischer Lösung. 2. Cu(II) wird im Protein/Cu(II)-Komplex zu Cu(I) reduziert, welches das gelbe Folin-Phenol (enthält u.a. Molybdat bzw. Wolframat) Reagenz intensiv blau färbt 3. aromatischen Aminosäurereste Tyrosin und Tryptophan reduzieren darüber hinaus das Folin-Reagenz direkt ohne vorherige Komplexierung mit dem alkalischen Cu(II)-Reagenz Blaufärbung quantitativ photometrisch bei 750 nm messbar

10 Bestimmung der Enzymaktivität: Unspezifische Esterasen Unspezifische Esterasen hydrolysieren Esterbindungen in vielen Biomolekülen und werden von vielen Mikroorganismen gebildet Aktivität dieser Enzyme kann daher als allgemeines Maß der heterotrophen Abbauaktivität angesehen werden Abschätzung des Potential einer Mikroorganismen-Gemeinschaft zur Hydrolyse von Biopolymeren

11 Enzymatische Untersuchungen: Wie?

12 Bestimmung der Enzymaktivität: Biochemische Grundlagen: Enzymaktivität: Maß für die Zahl der Substratmoleküle, die ein Enzym pro Sekunde umsetzt (=Umsatzrate, Wechselzahl) Steady state: k1=k-1>k2 Die katalytischen Eigenschaften eines Enzymes werden durch folgende Faktoren beeinflusst: Temperatur ph-wert Ionenstärke Substratkonzentration Hemmstoffe

13 Bestimmung der Enzymaktivität: Fluorescein-diacetat (lactoide Form) O O H 2 O Fluorescein COOH O O C O O C O O O OH CH 3 CH 3 Enzymatische Hydrolyse + 2 CH 3 COOH

14 Taxonomie und Charakteristika von Noroviren Genus Prototype Stamm Wirte Lagovirus Rabbit hemorrhagic disease virus Rabbit, hare Vesivirus Feline calicivirus Cats, pigs, dogs, Norovirus Norwalk virus Humans, pigs, cattle, sheep Sapovirus Sapovirus Humans, pigs Nebovirus Bovine enteric calicivirus Cattle Morphologie: unbehülte Virionen (35-40 nm) mit icosahedraler Symmetrie Genom: linear (+) ssrna (Baltimore Class IV); Länge kb

15 Bedeutung der Noroviren Weltweit verbreitet Verantwortlich für einen Großteil der nicht bakteriell verursachten Durchfallerkrankungen (Erwachsene > 50%!) Auftreten vor allem in Gemeinschaftseinrichtungen Übertragung fäkal-oral Diagnostik: PCR, Nachweis viraler Proteine (Antigen-EIA), Elektronenmikroskopie

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17 Real-time RT-PCR:

18 Real-time RT-PCR:

19 Real-time RT-PCR:

20 Real-time RT-PCR:

21 Real-time RT-PCR: Polymerase Chain Reaction -Enzymatische (Polymerase) Vervielfältigung spezifischer DNA-Sequenzen -Thermal Cycling: alternierendes Aufheizen / Abkühlung auf definierte Temperaturen -Hitzestabile DNA Polymerase (enzyme ursprünglig aus Bakterium Thermus aquaticus isoliert. DNA Polymerase synthetisiert enzymatisch neuen DNA Strang aus DNA-Bausteinen, die Nukleotide, mittels enzelsträngiger template-dna und DNA oligonukleotiden, sog. Primer, die für die Initiierung der PCR benötigt werden)

22 Real-time RT-PCR: Enzymatische Doppelsträngige Einzelsträngige Verlängerung Primer binden (ss) des (ds) DNA-Stranges C 60 C 72 C

23 Real-time RT-PCR: usw ,1 x 10^8 Kopien nach 30 Zyklen 2^n Kopien nach n Zyklen

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26 Real-time RT-PCR: RT: Reverse Transkription

27 Real-time RT-PCR: RT: Reverse Transkription Enzymatische Umschreibung von RNA bzw. mrna zu cdna

28 Real-time RT-PCR: RT: Reverse Transkription Enzymatische Umschreibung von RNA bzw. mrna zu cdna Enzym Reverse Transkriptase synthetisiert komplementären DNA-Strang

29 Real-time RT-PCR: RT: Reverse Transkription Enzymatische Umschreibung von RNA bzw. mrna zu cdna Enzym Reverse Transkriptase synthetisiert komplementären DNA-Strang cdna kann in nachfolgender PCR als Template genutzt werden

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31 Real-time RT-PCR: Zusätzlich zu Primern werden 1 oder mehrere spezifische Sonden genutzt Sequenzspezifische TaqMan Sonde mit Fluoreszenzfarbstoff und Quencher bindet zwischen Primern Taq-DNA-Polymerase besitzt 5-3 Exonukleaseaktivität und hydrolysiert Sonde und separiert Fluoreszenzfarbstoff und Quencher Zunahme an Fluoreszenz in der exponentiellen Phase der PCR kann direkt mit der Menge an Template-DNA korreliert werden

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33 Multiplexing -2 oder mehrere PCR assays werden in einer Reaktion kombiniert -Zielsequenzen werden gleichzeitig in der PCR amplifiziert, aber durch unterschiedlich markierte Sonden unabhängig voneinander detektiert -spart Probenmaterial, Kosten für Reagenzien, Zeit FAM-Quencher für Noroviren der Genogruppe I Anregung bei 495 nm Emission bei 520 nm CFG540-Quencher für Noroviren Genogruppe II Anregung bei 522 nm Emission bei 544 nm

34 Real-time RT-PCR: Quantifizierung: Exponentielle Vermehrung der DNA-Fragmente in der in den frühen Runden der PCR Verlangsamt sich später und erreicht ein Plateau Zunahme an Fluoreszenz in der exponentiellen Phase der PCR kann direkt mit der Menge an Template-DNA korreliert werden Als Maß nimmt man die Zykluszahl bei der das Fluoreszenzsignal sich gerade vom Hintergrund abhebt (Ct-Wert bzw. Cq-Wert)

35 Fluorescence (norm) ^5 10^4 10^3 10^2 10^ Cycle Ct[Cycle] Threshold: Baseline settings: (Noiseband) automatic, Drift correction OFF E E E+08 Amount[Copies] Slope: Standardkurve mittels bekannter Template-Mengen (z.b. 10, 10^2, 10^3 usw. Kopien) Y-Intercept: Efficiency: 1.18 Mittels R^2: Standarkurve kann aus Ct-Wert einer unbekannten Probe die Kopienzahl der Template DNA/cDNA berechnet werden

36 Plasmid DNA als Standard PCR-Produkte für Noroviren in DNA plasmide geklont Aufreinigung der Plasmide Ermittelung der DNA-Konzentration Mittels DNA Konzentration lässt sich die Plasmid-Kopienanzahl pro Volumen berechnen Für den Kurs bereit: jeweils Plasmide für Norovirus Genogruppe I und II mit einer Konzentration von 1 x 10^8 Kopien / µl

37 Tag Mo, Uhr Di, Uhr Versuch Einführung, 3.1. Gesamtzellzahlbestimmung mit DAPI-Färbung, 3.3. Bestimmung der kultivierbaren Zellen mit R2A-Agar 3.2. Proteinbestimmung nach Lowry 3.4. Bestimmung des Trockensubstanzgehaltes von Abwasserproben Auswertung Versuch Extraktion viraler Nukleinsäure aus Abwasserproben 5.3. Reverse Transkription der viralen RNA Mi, Uhr 4 Bestimmung der Enzymaktivität 5.4. Herstellen einer pdna Standard-Kurve 5.5. Real-time PCR für Noroviren GI und GII (läuft über Nacht) Do, Uhr Auswertung von Versuch 5.5. Gesamtauswertung

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