Bestimmung des Schlüsselenzyms für den biologischen Abbau mittels der Planreal DNA-Methodik PRA-DNA

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1 Bestimmung des Schlüsselenzyms für den biologischen Abbau mittels der Planreal DNA-Methodik PRA-DNA Dr. Christoph Henkler, Planreal AG Der biologische Abbau von Schadstoffen erfolgt in den Zellen durch Aktivierung der Enzyme, die dazu führen, schrittweise einen bioverfügbaren Schadstoff als Kohlenstoffquelle abzubauen. BTEX CO2 trigger degrades DNA (genes) RNA Enzymes Abb. 1 Schematische Darstellung der Aktivierung der Enzymbildung zum Abbau einer bioverfügbaren Kohlenstoffquelle (BTEX) Wenn Toluol oder andere Aromaten über die Zellmembran in die Zelle eindringen, wird die DNA aktiviert, es bildet sich RNA, die ihrerseits die Bausteine für die Bildung der Enzyme enthält. Aus der RNA bilden sich die Enzyme, die für einen schrittweisen Abbau der Aromaten notwendig sind. Auf diese Weise kann die Zelle Energie aus bioverfügbaren Kohlenstoffquellen generieren. Den schrittweisen aeroben Abbau von Toluol zu Kohlendioxid und Wasser zeigt Abbildung 2. Der energetisch wichtigste Schritt ist die aromatische Ringöffnung. Das Enzym Catechol 2,3-dioxygenase ist das Schlüsselenzym, dass erst die Ringöffnung ermöglicht und damit den weiteren Abbau von Toluol und zahlreichen anderen Aromaten. Eine elegante Methode ist die DNA-Analyse der lokal natürlich vorkommenden Mikroorganismen. Mittels PCR werden die relevanten Sequenzen im DNA-Strang ermittelt, die zur Bildung von dem gesuchten Schlüsselenzym führt. Dezember 2008 Seite 1 von 6

2 CO 2 + H 2 0 Abb. 2 Schrittweiser biologischer aerober Abbau von Toluol zu Acetaldehyd und Pyruvate, die weiter zu Kohlendioxid und Wasser abgebaut werden University of Minnesota Dezember 2008 Seite 2 von 6

3 2. Gewinnung repräsentativer Konsortien mittels der Planreal Matrix PM2 Mittels der Planreal-Matrix-Technologie PM2 werden zunächst Konsortien von Mikroorganismen aus den Grundwassermessstellen des zu untersuchenden Standortes gewonnen. Abb. 3 Elektronenmikroskopische Aufnahme, die ein breites Spektrum unterschiedlicher Mikroorganismen zeigt, die sich auf der Planreal Matrix PM2 im Grundwasser angesiedelt haben. 3. Polymerase Chain Reaction (PCR) zur Charakterisierung der DNA Im Labor wird die DNA von der Matrix extrahiert und mit ausgesuchten Oligonukleotidfragmenten (Primern) behandelt, welche komplimentär zu den genetischen Sequenzen des zu beprobendes Gens sind, das das Schlüsselenzym für den biologischen Schadstoffabbau kodiert. Die Primer Sequenzen werden entweder der Literatur entnommen oder mit einer speziellen Software wie Mac-Vektor oder mittels Datenbank on-line Analyse entworfen. Das Prinzip der PCR ist im folgenden Schema dargestellt (Abb. 4). Der Test wird über mehrere Zyklen (normalerweise 39) durchgeführt, um das Endprodukt (in diesem Fall die Catechol 1,2-Dioxygenase) milliardenfach zu amplifizieren. Das heisst, dass die Primer das gewünschte Genprodukt über mehrere Stufen amplifizieren so wie in Tabelle 1 dargestellt. Anzahl der PCR- Amplifiziertes Gen Zyklen Tabelle 1 Dezember 2008 Seite 3 von 6

4 Abb. 4 Schematische Darstellung der PCR-Methodik Mittels Gelelektrophorese, welches das genetische Material entsprechend des molekularen Gewichts in Bande separiert (im Fall der Catechol 1,2-Dioxygenase mit dem oben genannten Primern hat dieses Produkt eine Größe von 521 Basenpaaren [bp]), kann das Endprodukt sichtbar gemacht und analysiert werden. Dezember 2008 Seite 4 von 6

5 Abb. 5 Gelchromatogramm der untersuchten Proben mit positiver und negativer Kontrolle Abbildung 5 zeigt die amplifizierten Banden der Catechol 1,2-Dioxygenase. Als positive Kontrolle wurde DNA von Pseudomnonas putida F1 verwendet und steriles Wasser als negative Kontrolle. Auf dem Chromatogramm findet sich für die untersuchten Proben nur eine Bande, die entsprechend dem 100bp Marker bei 521 bp liegt und dem Standard entspricht. Übersicht Ergebnisse: Probe Produktgröße [bp] Ergebnis Bemerkungen P1 521 positiv* keine P2 521 positiv* keine Pos. Kontrolle 521 positiv* keine Dest. Wasser 0 negativ keine Interner Marker keine *Potential zur Bildung des Enzyms Catechol 1,2-Dioxygebnase nachgewiesen 4. Planreal s DNA Datenbank Planreal hat eine eigene Datenbank für viele biologischen Abbauwege organischer Substanzen und Software, die geeigneten Primer zu ermitteln. Dezember 2008 Seite 5 von 6

6 Planreal Module für weitere Informationen: Planreal s Sanierungsstrategie Schadstoffe, die biologisch behandelt werden können und Planreal Erfahrungen hat Planreal s Labormethoden zur Bewertung biologischer Reaktionen Planreal s Feldgeräte zur Messung und Kontrolle von in-situ / ex-situ biologischen Prozessen Bestimmung der Elektron-Transfer Bedingungen biologischer Reaktionen mittels der Planreal Methodik PRA-EDK-EAK Aktivierung des biologischen Abbaus von Perchlorethen (Per) und Trichlorethen (TCE) mittels des Konsortiums DHC-KB1 Bestimmung des Schlüsselenzyms für den biologischen Abbau mittels der Planreal Methodik PRA-DNA Bestimmung der biologischen Aktivität mittels der Planreal Respirations-Methodik PRA-RT100 bis PRA-RT1000 Bestimmung und Auswertung der Kinetik biologischer Reaktionen durch die Planreal Methode PRA-KIN Ermittlung der Öko-Toxizität für lokale Schadstoff-abbauende Bodenbakterien mittels der Planreal Methodik PRA-ÖT-02 Planreal s Patente und Verfahren Planreal s Referenzen von Grossprojekten Dezember 2008 Seite 6 von 6