Hochdurchsatz Generierung und Analyse von Arabidopsis thaliana-proteinen

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1 MAX-PLANCK-INSTITUT FÜR MOLEKULARE GENETIK Hochdurchsatz Generierung und Analyse von Arabidopsis thaliana-proteinen Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde des Fachbereichs Biologie, Chemie, Pharmazie der Freien Universität Berlin vorgelegt von Tanja Feilner geb. am in Bayreuth Berlin, September 2004

2 Erstgutachter: Prof. Dr. Hans Lehrach Zweitgutachter: Prof. Dr. Thomas Schmülling Tag der Disputation:

3 1 Einleitung Arabidopsis thaliana und die verwendeten Gewebe Arabidopsis thaliana (Ackerschmalwand) Die verwendeten Gewebe Proteomics Gewinnung von Proteinen im Hochdurchsatz Strategien zur Hochdurchsatz-Klonierung Proteinexpression im Hochdurchsatz Proteinaufreinigung im Hochdurchsatz Protein-Arrays und deren Anwendung Grundlagen zur Array-Technolgie Oberflächen Detektion Analytische und funktionelle Protein-Microarrays Phosphorylierung als eine posttranslationale Proteinmodifikation Mitogen-aktivierte Proteinkinasen (MAPKs) Zielsetzung Material und Methoden Material Chemikalien Proteine, Antikörper und Enzyme Synthetische Oligonukleotide Andere Materialien Labor-Ausrüstung Kits Medien, Puffer und Lösungen Medien Kompetente Zellen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Agarosegele Prozessierung der Koloniefilter Antikörper-Bindungstests mit Filtern SDS-Gelelektrophorese und Westernblot Proteinreinigung unter denaturierenden Bedingungen Proteinreinigung unter nativen Bedingungen Phosphorylierungs-Assay Software Stämme Plasmid-Konstrukte pqe30nastattb pqe30nastdv pentr1a Methoden Herstellung von zwei Arabidopsis cdna-bibliotheken cdna-synthese und Größenfraktionierung Fällung der cdna Vektorpräparationen...37

4 Ligation der cdnas mit den Vektoren Herstellung elektrokompetenter E. coli SCS1/pSE111-Zellen Ermittlung der Transformationskompetenz der kompetenten Zellen Transformation von E. coli mittels Elektroporation Anordnung und Replikation einer cdna-bibliothek Herstellung eines Proteinexpressionssubsets der cdna-expressionsbibliothek Herstellen von Hochdichte-Proteinfiltern der cdna-expressionsbibliothek Proteinexpression und Prozessierung der Filter Immunofärbung und Auswertung der Proteinfilter Neuordnung einer cdna-bibliothek zur Erstellung einer Unterbibliothek mit potentiellen Proteinexpressionsklonen Herstellung eines Uniklonsets einer Arabidopsis cdna-expressionsbibliothek Sequenzierung Qualitätskontrolle der Sequenzen BLAST-Analyse der Sequenzen Cluster-Analyse der Sequenzen Selektion der Klone für das Uniklonset Anordnung des Uniklonsets Erweiterung des Uniklonsets durch vollständige cdna-expressionsklone Weitere nukleinsäuretechnische Methoden Plasmidpräparation Sequenzierung und Sequenzanalyse PCR zur Amplifikation von DNA-Fragmenten Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Weitere proteinchemische Methoden SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) Westernblot Proteinexpression in E. coli in 96 well Format (1 ml Kultur) Denaturierende Aufreinigung im 96 well Format von Proteinen mit RGS His 6 -Tag Bradford-Test Spotten von aufgereinigten Proteinen auf beschichtete Glas-Microarrays (FAST TM -Slides) Herstellung eines Test-Microarrays Spotten der Proteine des Erweiterten Uniklonset Antikörper-screening der gespotteten Protein-Microarrays Kinase-Assays auf den Protein-Microarrays des Erweiterten Uniklosets mit radioaktivem γ-atp Detektion und Quantifizierung der potentiellen Phosphorylierungs-Targets Ergebnisse Herstellung der cdna-bibliotheken Verwendete Strategien cdna-synthese Vektorpräparation...73

5 3.1.4 Ligation, Transformation beider cdna-bibliotheken und Anordnung der Infloreszsenz cdna-bibliothek Charakterisierung der cdna-bibliotheken Bestimmung der durchschnittlichen Insertlängen Pistill cdna-bibliothek Infloreszenz cdna-bibliothek Sequenzanalysen beider cdna-bibliotheken Testsequenzierung der Pistill cdna-bibliothek Testsequenzierung der Infloreszenz cdna-bibliothek Erstellung einer Proteinexpressions-Unterbibliothek der ATM1 cdna-bibliothek Identifizierung potentieller Expressionsklone der ATM1 Bibliothek mit Hilfe von Hochdichte-Proteinfiltern Erstellung des Uniklonsets der ATM1 cdna-bibliothek Sequenzierung Sequenzanalyse BLAST-Analyse Cluster-Analyse Selektion der Klone für das Uniklonset Erweiterung des Uniklonsets durch cdna Expressionsklone, die in voller Länge vorlagen Reinigung von 96 rekombinanten Proteinen des Uniklonsets und Erstellung eines Testmicroarrays Bradford-Test Spotten und Phosphorylierung des Erweiterten Uniklonsets Detektion potentieller Phosphorylierungs-Targets Vorversuche Etablierung der Quantifizierung potentieller Targets im dichten Spotpattern Vergleich potentieller Phosphorylierungs-Targets der verschiedenen Kinasen Diskussion Gewinnung rekombinanter Arabidopsis Proteine Herstellung und Charakterisierung von zwei cdna-bibliotheken Identifizierung potentieller Expressionsklone und Herstellung der Proteinexpressions-Unterbibliothek Charakterisierung der Proteinexpressions-Unterbibliothek Erstellung des Uniklonsets Herstellung von Protein-Microarrays des Erweiterten Uniklonsets Phosphorylierungsstudien als Funktionelle Analyse Vergleich von Phosphorylierungsstudien Phosphorylierungsstudien mit den Proteinen des Erweiterten Uniklonsets Quantifizierung mittels Proteinkinase A Phosphorylierungsstudien unter Verwendung der Arabidopsis Kinasen MPK3 und MPK Literaturverzeichnis Abkürzungsverzeichnis...146

6 7 Zusammenfassung Summary Anhang Danksagung...170