Heterologe Expression einer funktionellen Domäne des nikotinischen Acetylcholinrezeptors

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1 Heterologe Expression einer funktionellen Domäne des nikotinischen Acetylcholinrezeptors Inauguraldissertation zur Erlangung der Doktorwürde am Fachbereich Biologie/Chemie/Pharmazie der Freien Universität Berlin vorgelegt von Cornelia Toepfer aus Berlin 2002

2 Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Chemie - Biochemie des Fachbereichs Biologie/Chemie/Pharmazie der Freien Universität Berlin in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. F. Hucho angefertigt. 1. Gutachter: Prof. Dr. F. Hucho Fachbereich Biologie/Chemie/Pharmazie der Freien Universität Berlin 2. Gutachter: Prof. Dr. W. Reutter Fachbereich Humanmedizin der Freien Universität Berlin Ort und Tag der Disputation: Berlin, 12. September 2002

3 I Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis...I 1 Einleitung Synaptische Signaltransduktion Struktur des nikotinischen Acetylcholinrezeptors Bisher bekannte Teilstrukturen von anderen Ionenkanälen Aufgabenstellung: Untersuchung der Struktur einer Proteindomäne Ergebnisse Nachweis der erfolgreichen Expression der intrazellulären Domäne Expression in Insektenzellen Baculovirus-Expression (pfastbac-vektor) Baculovirus-Expression (pbsv-8his-vektor) Transfektion von Sf9-Zellen Expression in Escherichia coli Expression der delta-schleife Expression der alpha7-schleife Expression in zellfreien Systemen Rapid Translation System (Roche) Cell-Free Protein Biosynthesis (RiNA GmbH) Diskussion der Ergebnisse Expression in Sf9-Insektenzellen Expression in E. coli In vitro-expression Ausblick Zusammenfassung Summary Material und Methoden Methoden zur Proteinbestimmung Bestimmung nach Bradford Bestimmung nach der BCA-Methode Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Western Blot Elektroblotting nach dem Semi-dry-Verfahren Proteinfärbung auf der Blotmembran Immunfärbung eines Western Blots Molekularbiologische Methoden Agarose-Gelelektrophorese Anzucht von Bakterien Herstellung kompetenter E. coli E. coli-transformation... 59

4 II Analytische Plasmidisolierung aus E. coli Präparative Plasmidisolierung aus E. coli DNA-Elution aus Agarosegelen DNA-Konzentrationsbestimmung Restriktionsverdau Ligation von DNA-Fragmenten Polymerase-Kettenreaktion (PCR) DNA-Sequenzierung Proteinexpression in E. coli Zellkultur von Sf9-Insektenzellen Anzucht und Pflege der Insektenzellen Auftauen von Insektenzellen Monolayer-Kultur Suspensionkultur Bestimmung der Viabilität Anlegen von Zellkonserven Transfektion der Sf9-Zellen mit Baculoviren Herstellung der Baculovirus-DNA Herstellung kompetenter DH10BAC-E. coli Transformation des pfastbac-plasmides in DH10BAC-E. coli Isolation der Bacmid-DNA Transfektion der Insektenzellen Amplifikation rekombinanter Baculoviren Bestimmung des Virustiters Expression durch rekombinante Baculoviren Transiente Transfektion der Sf9-Zellen Stabile Transfektion der Sf9-Zellen Indirekte Immunfluoreszenz von transfizierten Zellen Membranpräparation aus transfizierten Zellen Reinigung von exprimierten Proteinen Ni-NTA-Chromatographie Gluthation-Sepharose-Chromatographie In vitro-expression System der Firma Roche System der Firma RiNA Massenspektrometrische Analyse von Peptiden Peptidsequenzierung nach Edman Materialien Literaturverzeichnis Anhang Vektorkarten und verwendete Sequenzen Vektorkarten Expression in Sf9-Zellen durch Baculoviren Expression in Sf9-Zellen durch Transfektion Expression in E. coli (mit His6-Tag)... 93

5 III Expression in E. coli (GST-Fusionsprotein) Expression In vitro im RTS-System Sequenzen der exprimierten Fusionsproteine alpha-schleife in pfastbac1-gst beta-schleife in pfastbac1-gst gamma-schleife in pfastbac1-gst delta-schleife in pfastbac1-gst delta-schleife in pbsv-8his delta-schleife in pmib/v5-his alpha7-schleife in pgex-4t delta-schleife (komplett) in pet-15b delta-schleife (-7N) in pet-28a delta-schleife (-10C) in pet-28a MALDI-Komplettspektrum MALDI-PSD-Spektrum Abkürzungen und Einheiten Eigene Veröffentlichungen Lebenslauf Danksagung