VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN UND TABELLEN VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN UND TRIVIALNAMEN

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1 INHALTSVERZEICHNIS I VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN UND TABELLEN VII VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN UND TRIVIALNAMEN XIII 1 EINLEITUNG Osmoadaption halophiler Mikroorganismen Salt-in-cytoplasm -Strategie Compatible-solute -Strategie Kompatible Solute Ectoin und Hydroxyectoin Metabolischer Kreislauf des Ectoins Wirkung kompatibler Solute Wirkung auf ganze Zellen Wirkung auf Proteine Wirkung auf DNA Wirkung auf RNA Modelle der Wirkungsweisen kompatibler Solute Preferential interaction -Theorie (Arakawa und Timasheff, 1983) Osmophober Effekt (Bolen und Baskakov, 2001) Water replacement (Clegg et al., 1982) Biotechnologische Anwendung kompatibler Solute Ribosomen Aufbau des Ribosoms Translation Stabilisierung durch mono- und divalente Metallionen Stressbedingte Stabilisation in der Zelle Temperaturstabilität bakterieller Ribosomen 25

2 II Inhaltsverzeichnis 1.7 Zellfreie Protein-Synthese Zielsetzung der Arbeit 31 2 MATERIAL UND METHODEN Verwendete Bakterienstämme und Plasmide Nährmedien Medien für Zellkultur und Stammhaltung Medium für die Transformation von E. coli Medien für DSC-Messungen an ganzen Zellen Medienzusätze Anzucht und Kultivierung von Mikroorganismen Stammhaltung Flüssigkultur Verfolgung des Zellwachstums Gefriertrocknung Analytische Methoden Puffer und Lösungen für die Analytik Mikroextraktion des Zellmaterials (Bligh und Dyer, 1959) HPLC zur Bestimmung organischer Solute Molekulargenetische Methoden Puffer und Lösungen für die Molekularbiologie Isolierung genomischer DNA Isolierung von Plasmid-DNA Restriktionshydrolyse von DNA Ethanolfällung von DNA Konzentrationsbestimmung von DNA Polymerasekettenreaktion Ligation Agarosegelelektrophorese Denaturierende Agarosegelelektrophorese für RNA Herstellung kompetenter E. coli-zellen nach der CaCl 2 -Methode Transformation von E. coli Sequenzierung von DNA 47

3 III 2.6 Proteinbiochemische Methoden Puffer und Lösungen für die Proteinbiochemie Gesamtzellproteinaufreinigung BCA-Test Bradford-Test SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Isolierung bakterieller Ribosomen Aufreinigung von kruden 70S-Ribosomen Herstellung von Saccharosegradienten Aufreinigung der ribosomalen Untereinheiten Konzentrationsbestimmung isolierter Ribosomen und -untereinheiten Aufreinigung ribosomaler RNA Konzentrationsbestimmung von ribosomaler RNA Kalorimetrie Dynamische Differenzkalorimetrie Kalorimetrie an ganzen Zellen, Ribosomen und isolierten ribosomalen Untereinheiten Analyse der kalorimetrischen Messungen - Anpassung nach Gauß In vitro-transkription Die T7 RNA-Polymerase P266L Aufreinigung der T7 RNA-Polymerase Durchführung der in vitro-transkription Zellfreie Protein-Synthese Herstellung des S30-Zellextraktes Durchführung der zellfreien Protein-Synthese Nachweis der Luciferase-Aktivität Polysomen-Profile Verwendete Chemikalien Software und Internet-basierte Computerprogramme 70 3 ERGEBNISSE Kalorimetrische Messungen an intakten Zellen und Zellextrakten Kalorimetrische Messungen an intakten Zellen 71

4 IV Inhaltsverzeichnis Kalorimetrische Messungen an lysierten Zellen Kalorimetrische Messungen an beladenen Zellen Kalorimetrie an bakteriellen Ribosomen Isolierung bakterieller Ribosomen Kalorimetrie an isolierten Ribosomen Schmelzpunkt ohne kompatible Solute Kalorimetrie an isolierten Ribosomen mit verschiedenen Konzentrationen kompatibler Solute Effekt kompatibler Solute auf die Thermostabilität isolierter Ribosomen aus Escherichia coli K Effekt kompatibler Solute auf die Thermostabilität isolierter Ribosomen aus Halomonas elongata Wt Effekt von Salzen auf die Thermostabilität von Ribosomen Schmelzpunkt ohne kompatible Solute Schmelzpunkt mit kompatiblen Soluten Wirkung kompatibler Solute auf die Schmelztemperaturen aufgereinigter ribosomaler Untereinheiten Isolierung ribosomaler Untereinheiten Thermostabilität ribosomaler Unterheiten und der Einfluss kompatibler Solute Analyse der sequenziellen Unterschiede in den Ribosomen zwischen E. coli und H. elongata Die ribosomalen Proteine L10 und L25 in E. coli und H. elongata Heterologe Expression des ribosomalen Proteins L Zellfreie Protein-Synthese Aktivität des ZFPS-Systems bei unterschiedlichen Temperaturen Zellfreie Protein-Synthese mit einem Zellextrakt aus H. elongata Wt Einfluss kompatibler Solute auf die zellfreie Protein-Synthese Einfluss von Ectoin und Hydroxyectoin auf die zellfreie Protein-Synthese Einfluss der Ectoine auf die in vitro-transkription In vitro-transkription von ectc Analyse von Polysomen-Profilen DISKUSSION Kalorimetrie an intakten Zellen und Zellextrakten Kalorimetrie an intakten Zellen und Zelllysaten angezogen in verschiedenen Medien 140

5 V Thermische Stabilität zellulärer Komponenten in supplementierten Zellen Kalorimetrie an isolierten Ribosomen Thermostabilität isolierter Ribosomen aus E. coli und H. elongata Einfluss kompatibler Solute auf die Thermostabilität isolierter Ribosomen Effekt von Salzen auf die Thermostabilität isolierter Ribosomen Effekt kompatibler Solute auf die Thermostabilität NaCl-gestresster Ribosomen Vergleich der Daten aus den Ganzzellmessungen mit den Erkenntnissen der in vitro-messungen Unterschiede in den Ribosomen von E. coli und H. elongata Vergleich der ribosomalen RNA Vergleich der ribosomalen Proteine Zellfreie Protein-Synthese Zellfreie Protein-Synthese in H. elongata S30-Zellextrakt Zellfreie Protein-Synthese mit E. coli S30-Zellextrakt Einfluss der Ectoine auf die in vitro-transkription von luc Einfluss der Ectoine auf die in vitro-transkription von ectc Polysomen-Profile AUSBLICK Einfluss kompatibler Solute auf die Thermostabilität Zellfreie Protein-Synthese ZUSAMMENFASSUNG 177 LITERATURVERZEICHNIS 181 ANHANG 199 DANKSAGUNG 219