1 Einleitung Staphylokokken Koagulase-negative Staphylokokken MSCRAMM-Proteine LPXTG-Motive...

Transkript

1 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Staphylokokken Koagulase-negative Staphylokokken Staphylococcus saprophyticus MSCRAMM-Proteine LPXTG-Motive Oberflächenassoziierte Virulenzfaktoren von S. saprophyticus Zielsetzung Material Chemikalien Antibiotika Nährmedien Geräte Zentrifugen PCR-Cycler Sonstige Geräte Puffer Erstellung transformationskompetenter E. coli-zellen Mini-Plasmid-Präparation nach Doly (Birnboim und Doly, 1979) Maxi-Plasmid-Präparation mit dem Plasmid Midi Kit der Firma Qiagen Gelelektrophorese Aufreinigung von DNA mit dem QIAquick PCR Purification Kit der Firma Qiagen DNA-Isolierung aus Agarosegelen (präparatives Gel) mit dem QIAquick Gel Extraction Kit der Firma Qiagen

2 3.5.7 Aufreinigung genomischer DNA mit dem QIAamp Mini Kit der Firma Qiagen Protoplastentransformation von S. saprophyticus und S. carnosus DNA-Gewinnung aus Staphylokokken durch Kochlyse (Reischl et al., 2000) Puffer für die Durchflußzytometrie Puffer für die Kollagenadhärenztests Enzyme Verwendete Oligonukleotide Vektoren Zellinien Bakterienstämme Methoden Erstellung transformationskompetenter E. coli-zellen (modifizierte CaCl 2 - Methode) Transformation von E. coli (Hitzeschockmethode) Mini Plasmid-Präparation aus E. coli (alkalische Lyse nach Birnboim und Doly (Birnboim und Doly, 1979)) Maxi Plasmid-Präparation aus E. coli mit dem Plasmid Midi Kit der Firma Qiagen Agarose-Gelelektrophorese DNA-Isolierung aus Agarosegelen (präparatives Gel) mit dem QIAquick Gel Extraction Kit der Firma Qiagen Vektor-Dephosphorylierung mit CIP (calf intestinal phosphatase) Aufreinigung von DNA mit dem QIAquick PCR Purification Kit der Firma Qiagen Restriktion von DNA Restriktionsansätze Restriktionsansätze mit DNA einer Mini-Plasmid-Präparation

3 Restriktionsansätze mit DNA einer Maxi-Plasmid-Präparation Erfolgskontrollen der Maxi-Plasmid-Präparation Restriktionen von weiterverwendeter Maxi-Plasmid-Präparations- DNA Restriktionsansätze mit aufgereinigten PCR-Amplifikaten Verwendete Puffer für Mehrfachrestriktionen Ligation von DNA-Fragmenten Aufreinigung genomischer DNA von Staphylococcus saprophyticus mit dem QIAamp Mini Kit der Firma Qiagen Gramfärbung Herstellung von Protoplasten mit partiellem Lysostaphinverdau für S. saprophyticus und S. carnosus Transformation von Protoplasten Homologe Rekombination bei Staphylococcus saprophyticus Kochlyse zur DNA-Gewinnung von Staphylokokken (Reischl et al., 2000) Invasionsversuche von S. saprophyticus und S. carnosus mit Durchflußzytometrie (Szabados et al., 2008) Kollagenadhärenztest mit Bakterien (Sakinc et al., 2006) Speziesidentifikation anhand biochemischer Reaktionen Speziesidentifikation mit dem Vitek 2-Gerät der Firma biomérieux Speziesidentifikation mit Matrix-unterstützter Laser-Desorption/Ionisation Time-of-flight (MALDI-TOF MS) mit dem Microflex LT der Firma Bruker Daltonics PCR-Bedingungen PCR des kompletten sspp105-genes inklusive Randfragmenten aus S. saprophyticus Inverse PCR des sspp105-gens in puc PCR des Konstruktes aus sspp105-randfragmenten und ermb-cassette PCR der Randfragmente des sspp105-gens

4 PCR zum Nachweis von Kontinuität zwischen ermb-cassette und Randfragmenten des sspp105-gens PCR zum Nachweis der ermb-cassette PCR zum Nachweis des Repeats1 des Aas-Gens von S. saprophyticus PCR zum Nachweis des sspp105-gens von S. saprophyticus Software und Online-Datenbanken Ergebnisse Erstellung der sspp105-mutanten Erstellung des sspp105-knockout-konstruktes in E. coli Klonierung des sspp105-genes inklusive Randfragmenten in puc Mini-Plasmid-Präparation der 24 Klone aus der Transformation von puc18 und sspp Inverse PCR des sspp105 in puc Aufreinigung und Restriktion des PCR-Amplifikates der inversen PCR Religation und Transformation des ClaI-restringierten PCR- Amplifikates in DH5α und XL10 gold Mini-Plasmid-Präparation der 24 DH5α-Klone und Restriktion mit EcoRI Verifizierung der ClaI-Schnittstelle des klonierten Plasmides der Klone 4, 5, 7, 10, 11, 16 und Maxi-Plasmid-Präparation Klon Maxi-Plasmid-Präparation von pec4 aus DH5α Isolierung der ermb-cassette von pec Linearisierung und Dephosphorylierung des Vektors von Klon Ligation von Vektor-DNA aus Klon 7 und ermb-cassette mit anschließender Transformation in DH5α Verifizierung des erstellten Konstruktes im puc18-vektor in Klon 4 &

5 Isolierung des erstellten Konstruktes aus puc Schneiden des Vektors pbt2 mit EcoRI und PstI Ligation von pbt2 und Konstrukt mit Transformation in DH5α Verifizierung des Konstruktes im pbt2 von Klon Konstruktion des sspp105-knockouts in S. saprophyticus Protoplastentransformation in S. saprophyticus pbt2-elimination in S. saprophyticus Speziescharakterisierung und Verifizierung des Konstruktes in den Klonen 40, 71, 72 und Klonierung von sspp105 in S. carnosus TM Präparation von prb473 aus DH5α und Isolierung von sspp105 aus puc Ligation von sspp105 mit prb473 und Transformation in DH5α Protoplastentransformation in S. carnosus TM Charakterisierung der erstellten Stämme mittels eines durchflußzytometrischen Invasionsassays Kollagenbindungsaktivität der sspp105-knockout-mutante In-silico Analyse der sspp105-sequenz Diskussion Erstellung der sspp105-knockout-mutante von S. saprophyticus 7108 und der Rekombinate S.carnosus TM300+sspp Kollagenbindungsaktivität Charakterisierung der erstellten Mutanten mit einem durchflußzytometrischen Invasionsassay In-silico Analyse der sspp105-sequenz Zusammenfassung und Ausblick Literaturverzeichnis Anhang