Versuch 8. Plasmid - Isolierung

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1 Versuch 8 Plasmid - Isolierung Protokollant: Studiengang: Gruppen-Nr: Semester: Betreuer: Max Mustermann max@quantentunnel.de X X X C. Weindel & M. Schwarz Wird benotet?:

2 Einleitung Ein Plasmid ist ein kleiner extrachromosomaler DNA-Ring bei Prokaryoten, der zusätzliche Gene trägt. Ein Plasmid ersetzt also nicht die eigentliche genomische (auch ringförmige) DNA der Prokaryoten (Nucleoid, Kernäquivalent) sondern ergänzt diese nur, oft um Resistenzgene. Plasmide kann man vom Nucleoid einmal anhand der Länge unterscheiden (Plasmide sind viel kleiner) und zweitens, daran, dass das Nucleoid an der Zellmembran der Prokaryotenzelle angeheftet ist, Plasmide jedoch nicht. In der Gentechnik sind Plasmide eine beliebte Form um Fremd-DNA in Bakterienzellen einzuschleusen. Als Vektoren hierfür benutzt man häufig Bakteriophagen. Restriktionsenzyme (Endonucleasen) sind Abbauenzyme die Bakterien zum Schutz vor Fremder DNA dienen. Es gibt eine Fülle dieser Restriktionsenzyme wobei jedes Enzym seine spezifische Schnittstelle, eine spezielle DNA-Sequenz, hat an der es nur spalten kann. Diese Schnittstellen sind immer palindrome Nucleotidsequenzen, d.h. Sequenzen mit zweifacher Rotationssymetrie. Die Zielsequenz von EcoR1, einem Restriktionsenzym aus E.coli, zum Beispiel ist. 5 G A A T T C 3 3 C T T A A G 5 Um ihre eigene DNA vor dem Abbau durch die eigenen Endonucleasen zu schützen methylieren viele Bakterien die Zielsequenzen ihrer Restriktionsenzyme sodass diese nicht angreifen können. Manche Bakterien jedoch methylieren nicht, wie z.b. das im Praktikum verwendete Bakterium vom Stamm JM-101. Restriktionsenzyme werden auch in der Gentechnik als spezifische DNA-Scheren verwendet. Material und Methoden Der Versuch wurde nach Versuchsanleitung (Skript) durchgeführt. Es wurden zwei verschiedene Bakterienstämme verwendet (XL1-blue und JM-101) wobei jedoch beide das gleich Plasmid (Puc-19) enthalten.

3 Ergebnisse Auswertung Plasmide können in mehreren Konformationen auftreten. Die häufigste Form ist die spercoiled-struktur (superspiralisierte Form; kann man sich vorstellen wie einen verzwirbelten Haushaltsgummiring). Plasmide nehmen diese Form bevorzugt ein aufgrund von Platzmangel im Cytoplasma ( cellular crowding ). Ist ein Strang des DNA-Doppelstrangs gerissen (gebrochen) kann das Plasmid auch die offene Ringform (nick-circled-form) einnehmen. Weitere Konformationen, die allerdings im Vergleich zu den ersten beiden relativ selten vorkommen, aber auf dem Gel noch erkannt werden können, sind Dimere. Sie können aus zwei Plasmiden, von denen sich beide in der nick-circled- oder in der supercoiled-form befinden, bestehen (nick-circled-dimer/ supercoiled-dimer). Das Dimer kann aber auch ein Heterodimer aus einem Plasmid in der nick-circled-form und einem in der supercoiled-form sein, die ineinander verworren sind. Je nachdem in welcher Form die Plasmide vorliegen, das heißt welche räumliche Struktur sie besitzen, variieren auch die Laufeigenschaften der Plasmide auf dem Gel. Plasmide in der nick-circled-form sind sehr sperrig, wandern im Gel also langsamer als z.b. Plasmide in der supercoiled-form. Diese sind wesentlich kompakter und wandern somit auch schneller im engporigen Gel. Die Wanderungsgeschwindigkeit von linearer DNA ist nur geringfügig langsamer als die der supercoiled-dna.

4 Diskussion (anhand des rechten Gelbilds) Am Gelbild kann man nun den Banden die verschiedenen Plasmidformen zuordnen. Die oberste Bande (bei allen Spuren) stammt von genomischer DNA welche bei der Lyse der Bakterien mit in die Probe gelangt ist. Genomische DNA ist zu lang (zu sperrig ) um auf dem Gel zu wandern und bleibt somit schon am äußeren Rand des Gels hängen. Dies ist sehr günstig denn sonst könnte man auf dem Photo nicht erkennen, wo die Taschen sich befinden, und somit auch nicht die Wanderungsstrecke bestimmen. Die unterste Bande (bei allen Spuren) stammt von Plasmiden, die sich in der supercoiled-struktur befinden. Wie oben schon erwähnt, liegen die meisten Plasmide in dieser Form vor (dicke Banden) und besitzen dann auch im Vergleich zu den anderen Formen die höchste Wanderungsgeschwindigkeit. Bei meiner Spur (Spur 3) erkennt man auf der Höhe von ungefähr 6000 bp (siehe Marker) eine weitere Bande. Diese stammt wahrscheinlich von Plasmiden in der nickcircled-form. Die offene Ringform (nick-circled) kommt noch in Mengen vor die auf dem Gel sichtbar sind, da beim vortexen etliche Plasmide beschädigt wurden. Dimere kann man an meiner Probe nicht nachweisen. Anders bei Spur 1. Hier ist zwar auch die zweite Bande von oben die der offenen Ringform, allerdings liegt sie weiter oben. Die unterschiedlichen Laufeigenschaften lassen sich dadurch erklären, dass das Plasmid in Bakterien des Stamms JM-101 nicht methyliert werden. Somit kann das Plasmid andere Konformationen einnehmen und kommt somit zu anderen Laufeigenschaften. Unter der Bande der nick-circled- Form bei Spur 1 kommen noch zwei andere Banden von denen eine wahrscheinlich von Plasmiden in der supercoiled-dimer Struktur herrührt. In Spur 7 wurde Plasmidlösung von XL1-blue aufgetragen, die vorher mit dem Restriktionsenzym EcoR1 behandelt wurde. EcoR1 schneidet das verwendete Plasmid Puc19 nur an einer Stelle da sich im Plasmid auch nur eine geeignete Schnittstelle für das Enzym befindet. Es entsteht so aus dem Ring eine lineare DNA mit anderen Laufeigenschaften. Anhand der linearisierten DNA kann man nun bei Vergleich mit dem Marker die Länge (Anzahl der Basenpaare) des Plasmids bestimmen. In Spur 13 wurde eine VII-Marker-Lösung (Böhringer) aufgetragen.

5 Basenpaare (Standard VII) Laufstrecke [mm] , Nicht erkennbar 6106 Nicht erkennbar 4899 Nicht erkennbar , , , , , , , ,5 Die Laufstrecken wurden am Originalausdruck abgemessen. Eichgerade Laufstrecke [mm] y = -8,3602Ln(x) + 86,03 Eichgerade (Standard VII) Logarithmisch (Eichgerade (Standard VII)) Anzahl Basenpaare Die Bande der linearisierten DNA liegt bei einem Abstand von der Tasche (Laufstrecke) y = 19mm. Stellt man die Gleichung der Eichgeraden y = -8,3602 Ln(x) + 86,03 nach x (=Basenpaare) um so erhält man: x = exp (- y-86,03/8,3602). Setzt man die Laufstrecke der linearisierten Plasmid-DNA y = 19mm so ergibt sich ein Wert von x = exp (8,0178) = 3034 bp. Ermittelt man die Anzahl der Benpaare durch Ablesen von der Eichgeraden (Anhang) erhält man einen Wert von 3000 bp. Der Literaturwert für Puc 19 (Skript) liegt bei 2686 bp.

6 Eichgerade Laufstrecke [mm] y = -8,3602Ln(x) + 86, Anzahl Basenpaare Eichgerade (Standard VII) Logarithmisch (Eichgerade (Standard VII))