Molekularbiologie/ Genomics

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1 Cornel Mülhardt Molekularbiologie/ Genomics 5. Auflage ELSEVIER SPEKTRUM AKADEMISCHER VERLAG Spektrum k-zlakademischer VERLAG

2 Inhalt 1 Was ist denn "Molekularbiologie", bitteschön? Das Substrat der Molekularbiologie, oder: Molli-World für Anfänger Was brauche ich zum Arbeiten? Sicherheit im Labor 8 2 Einige grundlegende Methoden Nucleinsäure ist gleich Nucleinsäure und auch wieder nicht Methoden zur DNA-Präparation Bakterienmedien Präparation von Plasmid-DNA Minipräparation Maxipräparation Präparation von Phagen-DNA Präparation einzelsträngiger DNA mittels Helferphagen Präparation von genomischer DNA Die Reinigung von Nucleinsäuren Phenol-Chloroform-Extraktion Anionenaustauschersäulen Glasmilch / Silica-Membranen Cäsiumchlorid-Dichtegradient Fällung mit PEG Dialyse Magnetic Beads Proteinbindende Filtermembranen Alkohol-Fällung Konzentratoren Exonuclease-Phosphatase-Verdau Konzentrieren von Nucleinsäuren Alkohol-Fällung Konzentratoren Speed-vac "Aussalzen" Konzentrationsbestimmung von Nucleinsäure-lösungen 41 3 Das Werkzeug Restriktionsenzyme Gele Agarosegele 56

3 Inhalt DNA-Fragmente aus Agarosegelen isolieren Polyacrylamidgele (PA-Gele) DNA-Fragmente aus PA-Gelen isolieren Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) Kapillarelektrophorese Mikrochip-Kapillarelektrophorese Blotten Southern Blot Northern Blot Dot und Slot Blot 77 4 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die Standard-PCR Neue Entwicklungen Tipps zur Verbesserung der PCR Nested PCR Multiplex PCR Amplifikation langer DNA-Fragmente (> 5kb) PCR-Anwendungen Reverse Transkription - Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) Rapid Amplification of cdna Ends (RACE) Amplifikation zufälliger Produkte Klassische quantitative PCR Real-time quantitative PCR Inverse PCR Biotin-RAGE und Supported PCR Mutagenese mit modifizierten Primern ARMS (amplification refractory mutation System) in-situ-pcr Cycle Sequencing cdna-synthese Einzelzell-PCR RNA Methoden der RNA-Isolierung Methoden der mrna-isolierung Reverse Transkription (cdna-synthese) In-vitro-Transkription (RNA-Synthese) RNA-Interferenz (RNAi) 125

4 Inhalt XI 6 Die Klonierung von DNA-Fragmenten Die Grundlagen des Klonierens Klonieren von PCR-Produkten Klonieren mit Rekombinase-Systemen Mit welchen Vektoren klonieren? Plasmide Phagen Cosmide PACs und BACs YACs Welche Bakterien? Herstellen kompetenter Zellen und Transformation Probleme beim Klonieren Die Lagerung von Klonen Wie man DNA aufspürt Herstellung von Sonden Methoden zur Herstellung markierter Sonden Hybridisierung Nachweis der markierten DNA Autoradiographie Nicht-radioaktive Nachweismethoden Screenen von rekombinanten DNA-Banken Two-hybrid System Phage display DNA-Analyse Sequenzierung Radioaktive Sequenzierung Nicht-radioaktive Sequenzierung und automatische Sequenziergeräte Minisequenzierung Pyrosequenzierung zum Ersten Pyrosequenzierung zum Zweiten Schrotschuss-Sequenzierung Kurioses zum Thema Sequenzieren: Octamere Methoden zur Analyse von DNA auf Mutationen Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) Single-Strand conformation polymorphism (SSCP) 196

5 XII Inhalt Denaturierende Gradientengelelektrophorese (DGGE) Temporal temperature gradient electrophoresis (TTGE) Heteroduplexanalyse (HA) ARMS Enzymatische Spaltung von Fehlpaarungen Protein truncation test (PTT) Untersuchung der Funktion von DNA-Sequenzen Untersuchung der Transkription in Geweben Ribonuclease protection assay (RPA) Real-time quantitative PCR (RTQ-PCR) in-situ-hybridisierung Chromosomale Lokalisierung eines Gens (FISH) in-situ-pcr Microarrays Mutagenese ;. : in-vitro-translation ; Expressionssysteme Bakterielle Expressionssysteme Baculovirus-Expressionssysteme Weitere Expressionssysteme Heterologe Expression in Säugerzellen Transfektionsmethoden Kotransfektion mehrerer Gene Transiente und stabile Transfektionen Reportergene Transgene Mäuse Methoden des Gentransfers Regulation der Transgenexpression Das Tet-System Das Ecdyson-System Gentherapie Genomik Der Computer und Du Tipps für die Karriereplanung, oder: Der ganz kleine Macchiavelli für Jungforscher Zu guter Letzt 280

6 Inhalt XIII 13 Anhang 28" Nützliche Tabellen Standardlösungen Glossar Wer, was, wo? Lieferanten / Adressen Literatur 292 Register 294