1 Einleitung Glucoserepression Zielsetzung Material und Methoden... 25

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Eike Günther
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1 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Zuckerstoffwechsel von Saccharomyces cerevisiae Glucoseinaktivierung Glucoseinduzierter gezielter mrna-abbau Glucoserepression Der Cat1/3p-Kinasekomplex Cat1/3p- -Untereinheiten Weitere Komponenten des Cat1/3p-Kinasekomplexes Substrate des Cat1/3p-Kinasekomplexes Cat8p als Genregulator der Gluconeogenese und des Glyoxylat-Zyklusses Einfluß des Cat1/3p-Kinasekomplexes Zielgene des Transkriptionsfaktors Cat8p Computergestützte Analysen Genome-wide expression patterns (Microarray Analysen) Proteinanalyse Zielsetzung Material und Methoden Stämme Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Plasmide Medien Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Paarung, Sporulation und Tetradenanalyse Molekularbiologische Techniken I

.. 15 1.6 Cat8p als Genregulator der Gluconeogenese und des Glyoxylat-Zyklusses... 17 1.6.1 Einfluß des Cat1/3p-Kinasekomplexes... 19 1.6.2 Zielgene des Transkriptionsfaktors Cat8p... 20 1.

2 2.5.1 Transformationen Plasmidpräparationen Enzymatische DNA Modifikationen Auftrennen von DNA-Fragmenten im Agarose-Gel Polymerase-Ketten-Reaktion PCR mit chromosomaler DNA oder Plasmiden als template der Reaktion PCR mit ganzen Zellen (E. coli oder S. cerevisiae) Reinigung der PCR-Produkte Stammkonstruktionen Epitop-markierte Hefestämme GFP-Fusionen Kulturbedingungen Anzucht zur Bestimmung der -Galaktosidase-Aktivität Anzucht zur Bestimmung der Fructose-1,6-bis-phosphatase-Inaktivierung (FBPase) Anzucht zur Rohextraktgewinnung für Coimmunopräzipitationen Anzucht zur RNA-Isolierung Rohextraktgewinnung Rohextraktgewinnung für -Galaktosidase- und Fructose-1,6-bis-phosphatase- Enzymtest Rohextraktgewinnung für Coimmunopräzipitationen Proteinbestimmungen Proteinbestimmung nach der Mikrobiuret-Methode Proteinbestimmung nach der BCA-Methode Enzymtests Bestimmung der -Galaktosidase Bestimmung der Fructose-1,6-bis-phosphatase Inaktivierung der Fructose-1,6-bis-phosphatase (FBPase) Inaktivierung Reaktivierung Wachstumstests II

.. 35 2.7 Stammkonstruktionen... 35 2.7.1 Epitop-markierte Hefestämme... 35 2.7.2 GFP-Fusionen... 36 2.8 Kulturbedingungen... 37 2.8.1 Anzucht zur Bestimmung der -Galaktosidase-Aktivität... 37 2.8.2 Anzucht zur Bestimmung der Fructose-1,6-bis-phosphatase-Inaktivierung (FBPase).

3 2.14 Coimmunopräzipitation Präparation der -HA-beads Präzipitation Kinaseassay SDS-PAGE Vorbereitung der Proben SDS-Gele Western-blot Semi-dry-blot Tankblot Antikörperinkubation Isolierung von RNA aus S. cerevisiae Zellen Northern-blot Northern-Hybridisierung Sondenherstellung Hybridisierung Klonierungen Two Hybrid Konstruktionen Promotor-lacZ-Fusionen Klonierung von NPR Two Hybrid System Direktes Two-Hybrid Two-Hybrid Analyse Ergebnisse Untersuchungen zur CAT8-Promotoraktivität Einfluß verschiedener nicht-fermentierbarer Kohlenstoffquellen auf die Expression des CAT8 Genes Einfluß des Wachstumsverhaltens bezüglich nicht-fermentierbarer C-Quellen Einfluß des Cat1/3p-Kinasekomlexes Einfluß der Glucoserepression III

21 Northern-Hybridisierung... 45 2.21.1 Sondenherstellung... 45 2.21.2 Hybridisierung... 45 2.22 Klonierungen... 46 2.22.1 Two Hybrid Konstruktionen... 46 2.22.2 Promotor-lacZ-Fusionen... 47 2.22.3 Klonierung von NPR1.

4 3.2 Interaktionen zwischen dem Cat1/3p-Kinasekomplex und Cat8p Interaktionen des Gal4p-Bindedomänen-Cat8p-Fusionsproteins im Two-Hybrid System Coimmunopräzipitation mit einer HA 3 -Epitop markierten Variante von Cat8p Kinaseassay Wachstumsverhalten verschiedener Stämme auf unterschiedlichen Medien Weitere Interaktionspartner des Transkriptionsfaktors Cat8p Versuche zur Suppression verschiedener Deletionsmutanten mit einem konstitutiven Fructose-1,6-bis-phosphatase Allel Einfluß der cat8 Deletion auf die Glucoseinaktivierung Ist UBC8 ein Cat8p Zielgen? Glucoseinaktivierung eines konstitutiven Fructose-1,6-bis-phosphatase Allels Glucoseinaktivierung der FBPase unter Verhinderung der Proteinbiosynthese durch Gabe von Cycloheximid Reaktivierung von Fbp1p REG2 als Cat8p Zielgen Suche nach neuen Zielgenen der Regulationskaskade Northern-blot Analyse Promotor-LacZ-Fusionen Funktionsanalyse von YCR010c und YGR067c Diskussion Die CAT8-Promotoraktivität wird von Faktoren der Repression und Derepression beeinflußt Einfluß des Wachstumsverhaltens der untersuchten Stämme auf die CAT8-lacZ Expression Einfluß des Cat1/3p-Kinasekomplexes Einfluß der Glucoserepression durch Mig1p und Mig2p Der Cat1/3p-Kinasekomplex interagiert mit Cat8p Weitere potentielle Interaktionspartner Einfluß von cat8 auf die Glucoseinaktivierung von Fbp1p IV

5 Versuche zur Suppression verschiedener Deletionsmutanten mit einem konstitutiven Fructose-1,6-bis-phosphatase Allel... 74 3.6 Einfluß der cat8 Deletion auf die Glucoseinaktivierung... 78 3.6.1 Ist UBC8 ein Cat8p Zielgen?

5 4.5 Neue Zielgene des Transkriptionsfaktors Cat8p Einfluß verschiedener Deletionen auf das pseudohyphale Wachstum Bedeutung der computergestützten Analysen für den Cat1/3p-Kinasekomplex Zusammenfassung Referenzen V

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Abbildungsverzeichnis

I INHALTSVERZEICHNIS Abkürzungen VI Abbildungsverzeichnis VIII I. Einleitung 1. Neurone und Axonwachstum 1 2. Oligodendrozyten und Myelin 3 3. Das Proteolipid Protein (PLP) 6 4. Mutationen im PLP-Gen und