Labortechniken (2) Amplifikationskurve (linear linear) Realtime-PCR

Transkript

1 Realtime PCR Quantitative PCR Prinzip: Nachweis der PCR-Produkte in Echtzeit und Quantifizierung anhand eines fluoreszenten Reporters R Q Taq-Polymerase Synthese- und Nuklease-Einheit R=Reporter, Q=Quencher Material: wie bei der konventionellen PCR aber zusätzlich eine Sonde (Taqman probe) Labortechniken (2) Funktionsweise der Hydrolyse-Sonden 1. die synthetische Einheit der Taq-Polymerase synthetisiert den Gegenstrang 2. die Taq-Polymerase stößt auf die Sonde, die anschließend durch die Nuklease-Einheit der Taq-Polymerase hydrolysiert wird 3. durch die räumliche Trennung von Reporter und Quencher entsteht ein Fluoreszenzsignal, das proportional zu der Menge an PCR-Produkt zunimmt

2 Amplifikationskurve (linear linear) Plateau exponientiell Realtime-PCR linear konventionelle PCR Labortechniken (2) Amplifikationskurve (linear log) threshold (Schwellenwert) threshold cycle C t (Zyklus, bei dem die Amplifikationskurve den Schwellenwert kreuzt)

3 Amplifikationskurve (linear log) Standards Anzahl Moleküle Labortechniken (2) Standardgerade (C t vs. log c 0 ) Effektivität = 10 (-1/slope) -1 (100% Eff. bei einer Steigung von -3,34) C t = m log(c) + b c = 10 (C t-b)/m

4 Bericht (Report) Labortechniken (2) 7300 Realtime PCR System

5 7300 Realtime PCR System - Schublade Labortechniken (2) Pyrosequencing-Reaktion (1) 1. PCR mit einem biotinyliertem Primer Biotin 2. Denaturierung des PCR-Amplifikates Biotin 3. Binden des biotinylierten DNA-Stranges an Streptavidin-Kügelchen Kügelchen Biotin Streptavidin Sequenzierungsprimer

6 Pyrosequencing-Reaktion (2) Labortechniken (2) Film ab!

7 PyroMark ID Labortechniken (2) PyroMark ID - Cartridgehalterung

8 PyroMark ID Einheit für Mikrotiterplatte Mikrosatellitenanalyse

9 Genom Viele höhere Organismen besitzen während der Hauptphase ihrer Entwicklung einen diploiden Chromosomensatz, d.h. die Zellen enthalten jedes Chromosom in zweifacher Ausfertigung (eines von jedem Elternteil). Dabei handelt es sich in der Regel nicht um identische Kopien: Zwar passen beide hinsichtlich Form, Struktur und der Abfolge der Genorte genau zueinander - darum spricht man von homologen (gleichartigen) Chromosomen die Gene selbst jedoch können in verschiedenen Ausführungen (Allelen) vorliegen. Kodierende/ nicht kodierende Bereiche

10 Mikrosatelliten nicht kodierende, repetitive DNA-Sequenzen (Bsp.: CACACACACA) wiederholter Abschnitt: 2-6 Basenpaare Anzahl der Wiederholungen= stark variabel (hohe Mutationsrate): - Beeinflussung der Gesamtlänge des MS - geeignet als Genmarker Anwendung Vaterschaftsnachweis, Bestimmung des Verwandtschaftsgrades Kopplungsanalyse Genomkartierung, u.a.

11 Beispiel: Vaterschaftsnachweis Primer Suche nach einem MS im Genom flankierende Sequenzen beidseits des MS= Primer einmalig an diesem einen Locus=> funktionieren für jedes Individuum einer Spezies forward- Primer GATCTCTCTCTGTCTTATCTACACACACACACACACACACACAC ACACACACACACACACACACACACAGAGCTTTGGCCCTCCG AAGAGTTCTCTCAGGGCTAAGAAAGGACGAGGTTGATGTCT GAACACCTAACAAAGCGTAACCTCGTCCTTTCTTAGCC reverse-primer

12 Verfahren 1. Der DNA- Abschnitt, der den MS enthält, wird mittels PCR amplifiziert (Primer) 2. Die Größe des Amplifikats hängt ab von der Anzahl der Wdh. innerhalb des MS 3. Das Amplifikat wird auf ein Gel aufgetragen und eine Gelelektrophorese durchgeführt (Auftrennung der DNA- Fragmente nach Größe) 4. Normalerweise: 2 Allele für alle MS gibt es einen Unterschied i.d. Anzahl der Wiederholungen zwischen diesen beiden Allelen, erscheinen 2 separate Banden auf dem Gel

13 In vitro- Ergebnisse heterozygot homozygot Multiplex- PCR Längenstandard Null- Allel QTL- Analyse Phänotyp: Zusammenspiel verschiedener Gene unterschiedlich starker Einfluß der jeweiligen Gene Ziel: Identifikation der Gene mit möglichst großem Einfluß Beispiel Krankheitsresistenz: Phänotyp= resistente/ empfindliche Tiere

14 Rolle der Mikrosatelliten bei der QTL- Analyse Klärung des Erbganges: Taucht ein Mikrosatellit stets bei Tieren mit einem bestimmten Phänotyp auf, ist davon auszugehen, daß ein für diesen Phänotyp verantwortliches Gen gemeinsam mit dem Mikrosatellit vererbt wird (Kopplung) Da Lokalisation der Mikrosatelliten bekannt => ungefähre Lokalisation des relevanten Gens auf dem Chromosom Prüfung: Welche Gene liegen in diesem Bereich des Chromosoms? Vielen Dank für die Aufmerksamkeit!