PCR-ELISA. Eine Methode zur Pathogendiagnose und zur Ermittlung der Befallsstärke

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1 PCR-ELISA Eine Methode zur Pathogendiagnose und zur Ermittlung der Befallsstärke Luitgardis Seigner und Stefan Knabel * Bayerische Landesanstalt für Landwirtschaft Institut für Pflanzenschutz * Ehemaliger wissenschaftlicher Mitarbeiter der LfL

2 Der PCR-ELISA Extraktion der Erbsubstanz Der PCR-ELISA ist eine Kombination aus molekularbiologischen (PCR und Gensonden-Hybridisierung) und serologischen Techniken. Er kann zum Nachweis von Pilzen, Bakterien, Viren und Viroiden eingesetzt werden. Der PCR-ELISA besteht aus folgenden Einzelschritten: Isolierung der Erbsubstanz des Erregers. Durchführung der PCR unter Verwendung erregerspezifischer Primer. Bindung der e an eine. Ankopplung einer erregerspezifischen Gensonde an das gebundene. Messung der Färbung. Die Intensität der Färbung ist ein Maß für die Befallsstärke. PCR Serologischer Nachweis der Gensonde über eine Farbreaktion. markierte Sonde Antikörper + Enzym blau Erbsubstanz (meist DNA) gelb Messung 2 n DNA- Nachweis des es

3 Die Vorteile des PCR-ELISAs

4 Höhere Sensitivität als die PCR Sehr hohe Spezifität Quantifizierung der Befallsstärke Durchführung in der parallele Untersuchung einer großen Anzahl von Proben sehr gute Eignung für die Routine

5 Aus der Kombination von PCR (erregerspezifische Primer) und Sondentechnik (erregerspezifische Gensonde) resultiert die sehr hohe Spezifität

6 Die Teilschritte des PCR-ELISAs

7 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ursprünglicher DNA- Doppelstrang Endprodukte exponentielle Anreicherung der DNA-Stränge Zuerst wird eine PCR durchgeführt. Dabei werden erregerspezifische Primer eingesetzt. Ein Enzym vervielfältigt dabei definierte Abschnitte des Erbmaterials des Erregers.

8 Denaturierung der e : Doppelstrang Denaturierung : Einzelstränge Nach der PCR liegen die e doppelsträngig vor. Sie werden durch Denaturierung in Einzelstränge zerlegt. Dabei werden die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Einzelsträngen gelöst.

9 Bindung der e an eine (Einzelstrang) Die einzelsträngigen e werden an eine gebunden.

10 Zugabe der Gensonde markierte Gensonde Es wird eine erregerspezifische Gensonde dazugegeben. An dieser Sonde hängt eine Markierung : = markierte Gensonde.

11 Bindung der Gensonde an das markierte Gensonde Die markierte Gensonde bindet spezifisch über Wasserstoffbrückenbindungen an eine ganz bestimmte Stelle des es.

12 Antikörper-Ankopplung markierte Gensonde Antikörper Enzym Ein spezischer Antikörper reagiert mit der markierten Gensonde. An dem Antikörper hängt ein Enzym.

13 Farbreaktion markierte Gensonde Antikörper Substrat blau Enzym Substrat gelb Messung Nach Zugabe eines Substrates bewirkt das Enzym einen Farbumschlag. Die Intensität der resultierenden Färbung wird mit einem Photometer gemessen und ist ein Maß für die Befallsstärke.