Wasserchemie Modul 7

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1 Wasserchemie Modul 7 Prinzip eines heterogenen Enzyme ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay Was sind Antikörper Antikörper (Immunoglobuline) sind Eiweißstoffe stoffe,, die Tiere und Menschen zur Abwehr von Antigenen (Infektionserregern oder körperfremdem biologischem Material) produzieren Da sie spezifisch für bestimmte Schadstoffgruppen sind, können sie für die chemische Analytik genutzt werden Schematische Darstellung der Spezifität der Antigen- Antikörperreaktion (Schlüssel-Schloss-Prinzip) 1

2 Was sind Antikörper richtiges Antigen Antikörper falsches Antigen Was sind Antikörper Bekanntestes Beispiel: Schwangerschaftstest Es wird unterschieden in polyklonale und monoklonale Antikörper Monoklonale werden durch Klonen erzeugt In der Analytik wird unterschieden in homogene und heterogene Assays Bei heterogenen Assays wird die Wasserprobe zu einem bestimmten Zeitpunkt eliminiert: für getrübte Proben geeignet Neben ELISA gibt es auch andere Verfahren: z.b.. RIA (Radioimmunoassay) 2

3 Zwischen Antigen, Antikörper und Antigen-Antikörper-Komplex besteht ein Gleichgewicht, das auf der Seite des Antigen-Antikörper-Komplexes liegt. Antigen + Antikörper Antigen-Antikörper-Komplex Um eine quantitative Aussage über die Konzentration eines der eingesetzten Reagenzien zu erhalten, muss entweder das Reaktionsprodukt oder das Reagenz selbst messbar sein. Markierungssubstanzen Marker Radioaktive Substanz, z.b. 125 I Enzym Fluorisierende Gruppe Chemielumineszenz erzeugende Verbindungen Elektroaktive Marker Stabiles Radikal Phagen Test Radioimmunoessay Enzym-Immunoessay Lumineszenz- Immunoessay Fluoreszenz- Immunoessay Nachweis der Antigen- Antikörper rper-reaktion Elektro-Immunoessay Spin-Immunoessay Viro-Immunoessay heterogen heterogen homogen heterogen homogen homogen homogen heterogen Technik heterogen (ELISA) homogen (EMIT) 3

4 Hapten Kleine (organische) Moleküle, die zur Gruppe der Antigene gehören, sich von denen jedoch dadurch unterscheiden, dass sie nicht alleine in der Lage sind, eine Immunreaktion hervorzurufen. Dies ist nur möglich, wenn sie an ein Trägermolekül (z.b. ein Protein) gebunden werden. Somit sind sie zwar Antigene, aber keine Immunogene. Antikörper Hapten (z. B. ein Pestizid) Hapten mit Enzym markiert (Tracer) 4

5 Die im Wasser befindlichen Haptene und die markierten Haptene (Tracer) konkurrieren um die Bindungsplätze an den Antikörpern Die Probe wird entfernt. Die gesuchte Information (das Verhältnis markierter zu unmarkierter Haptene) ist auf den Antikörpern gebunden 5

6 Nun wird ein Substrat in wässriger Lösung zugegeben. Es kann nur mit den enzymmarkierten Haptenen (Tracer) reagieren und eine Färbung des Wassers verursachen Waren viele enzymmarkierte Tracer auf den Antikörpern gebunden, so wird die Farbreaktion stark sein. Waren wenig oder keine Tracer gebunden, ist die Farbreaktion klein oder nicht nachweisbar. Intensive Farbe kleine Konzentrationen an Haptenen (z.b. Pestizid) Geringe Färbung hohe Haptenkonzentrationen 6

7 Kalibrierung Kalibrierung ELISA 0,8 0,7 Absorption (450 nm) 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0,001 0,01 0, Konzentration [µg/l] Elisa-Kit 7

8 Was wird benötigt tigt? ELISA Kit für Zielsubstanz Photometer * Reagenzglaskit jedes Photometer * Streifenkit Streifenphotometer * Platte Platten-Photomter Photomter Was kann im Wasser analysiert werden? Pestizide PAK s, Dioxine PCB s,, PCP Metalle / Metalloide / metallorganische Verbindungen Hormone, Medikamente Organismen (Viren, Bakterien, ) 8

9 Was ist zu beachten? Mengen genau dosieren Zeiten exakt einhalten Kreuzreaktivitäten ten berücksichtigen Antikörper altern / Kalibrierung Kühl lagern / Aufwärmen ELISA vs klassische Analytik Vorteile ELISA Nachteile ELISA Extrem sensitiv keine Anreicherung Geringes Probenvolumen Geringe In vestition Schnell Vorort möglich Kreuzreaktivität preisgünstig Geringere Präzision Nicht DIN /ISO konform single-target target-verfahren Kreuzreaktivität Höhere Verbrauchskosten Kühle Lagerung / Verfallsdatum 9

10 Probleme / Möglichkeiten Falsch positive Befunde? Nur einmal verwendbar? Automatisierbar? Sensortauglich Zusammenfassung ELISA sind sensitiver als jeder physikalische/chemische Detektor Geringe Probenvolumnia /keine Anreicherung Single target / Kreuzreaktivität Primär kein Ersatz klassischer Analytik / Ergänzung Screening 10