Immunserologie III. ELISA, Western-blot, Dot-blot

Transkript

1 Immunserologie III. ELISA, Western-blot, Dot-blot Universität ität Pécs, Medizinische Fakul ultät Institut für Immunologie und Biotechnologie ie

2 ELISA 1. - Grundlagen o Enzyme o Linked o Immuno o Sorbent o Assay

3 Indirekter Immunoassay Die Kavitäten der Mikrotiterplatte sind mit verschiedenen Antigenen beschichtet, die unspezifischen Bindungstellen sind schon blockiert - Gebrauchsfertig Jeweils, 100 µl Kontrolle und vorverdünnte Patientenproben in die Mikrotiterplatte pipettieren Inkubationszeit: 30 Minuten bei Raumtemperatur Kavitäten entleeren, und dreimal mit jeweils 300 µl Waschpuffer waschen Jeweils 100 µl Enzymkonjugatlösung in die Kavitäten der Mikrotiterplatte pipettieren Inkubationszeit: 15 Minuten bei Raumtemperatur Kavitäten entleeren, und dreimal mit jeweils 300 µl Waschpuffer waschen Jeweils 100 Substratlösung (TMB) in die Kavitäten der Microtiterplatte pipettieren Inkubationszeit: 15 Minuten bei Raumtemperatur 100 µl Stoplösung in jede Kavität pipettieren, und die Platte ca. 5 Minuten stehen lassen Messung der optischen Dichte im Plattenphotometer bei einer Wellenlänge von 450 nm

4 Proben ANA Screen : Suchtests von Antikörpern gegen Zellkerne (ANA) und Cytoplasma- Bestandteile Antigengemisch aus dsdns, Histonen, nrnp/sm, Ribosomalen P-Proteinen, Zentromeren Indikationen: Sharp-Syndrom (MCTD), Lupus erythematodes disseminatus, Sjögren-Syndrom, Progressive Systemsklerose, Polymyositis/Dermatomyositis ANCA Screen (Anti-Neutrophyle zytoplasmische Antikörper) MPO (Myelo-peroxidase) (panca) PR3 (Proteinase 3) (canca)

5 ELISA 2. - Grundlagen Basiert auf der Antigen Antikörper Wechselwirkung Antigen oder Antikörper wird an eine feste Fläche (96-Well-ELISA- Platte) gebunden- Sensibilisierung (Die Plastikoberflächen binden die verschiedenen Proteine aspezifisch) Die gesuchten Moleküle binden durch spezifische Antigen-Antikörper Wechselwirkung an die feste Oberfläche Die Immunkomplexe können in einem oder mehreren Schritten sichtbar gemacht werden. (mit direkter, indirekter oder Streptavidin/Biotin Markierung Die restlichen Komponenten - die sich nicht an die Oberfläche binden - werden ausgewaschen Die vorhandenen freien Bindungsstellen müssen noch abgesättigt werden. Dazu benötigt man ein Protein, mit dem der Antikörper nicht kreuzreagieren kann, z.b. BSA (bovine serum albumin) oder fettarmes Milchpulver.

6 ELISA 3. einfach,, direkt =Antigen =markierter Antikörper

7 ELISA 4. einfach,, indirekt z.b. für Untersuchung der Antikörperproduzierung der Hybridomen =Antigen =unmarkierter primärer Antikörper =markierter sekundärer Antikörper

8 ELISA 5. einfach,, indirekt

9 ELISA 6. Sandwich Sandwich-ELISA ist geeignet, ein gegebenes Antigen in einer mehrere Antigene enthaltenen Lösung quantitativ nachzuweisen. (z.b. vom Serum, oder von anderen biologischen Proben Hormone, Zytokine, Autoantikörper die sehr niedrige Konzentration haben) Voraussetzung: Zwei monoklonale Antikörper werden gegen zwei verschiedene Epitopen von demselben Antigen verwendet

10 ELISA 7. Sandwich =Antigen =unmarkierter primärer Antikörper =markierter sekundärer Antikörper

11 ELISA 8. Kompetition

12 Substratsysteme

13 Routine- ELISA Befund

14 Dot - blot Das Antigen wird auf eine Nitrozellulosemembran getropft (fester Träger). Nach der Austrockung reagiert es mit dem Antikörper Nach der Entwicklung können wir ein vom Substrat oder kemilumineszentes Signal stammendes farbiges Produkt detektieren

15 Western - blot Proteintrennung nach ihrer Größe SDS PAGE. Transfer auf einem festen Träger (Nitrozellulose-, Zelluloseacetatmembran) blotting Reaktion mit dem Antikörper,dann Entwicklung (z.b. kemilumineszenter Reagent, NBT-BCIP)