Fisch Mucosa Test Verfahren zur Erfassung von Fremdstoffen mit östrogener Wirkung und anderen endokrinen Disruptoren

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Jakob Frank
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1 Fisch Mucosa Test Verfahren zur Erfassung von Fremdstoffen mit östrogener Wirkung und anderen endokrinen Disruptoren Umfassende Freilandstudien haben gezeigt, dass die Geschlechtsdifferenzierung von barschartigen Fischen von exogenen Stimuli u.a. Fremdstoffen in höherem Maße beeinflussbar ist als bei Karpfenartigen. Diese Eigenart konnte jedoch bisher nicht in der Schadstoffforschung genutzt werden. Eine zuverlässige bioanalytische Bestimmung des östrogen-kontrollierten Dotterproteins Vitellogenin (VG) war aufgrund der Instabilität des Moleküls im Blut nicht möglich. Mit dem Fisch Mucosa-Test wird eine Tier schonende standardisierte Messung dieses zentralen Endpunktes aller OECD Testverfahren zur Erfassung von endokrinen Wirkungen ermöglicht. Dies und die Nutzung von eingeschlechtlichen Testfischen ergeben ein gleichermaßen sicher, reproduzierbar und einfach zu handhabendes ökotoxikologisches Testverfahren. Ein vergleichbares Testsystem haben wir parallel für den Einsatz an karpfenartigen Fischen entwickelt.

Diese Eigenart konnte jedoch bisher nicht in der Schadstoffforschung genutzt werden.

2 Komponenten des Verfahrens sind: Standardisierte eingeschlechtliche Testorganismen Reproduzierbare schonende Probennahme Hautabstrich vom lebenden Tier, anstatt invasiver Blutentnahme und Serumgewinnung keine Probenaufbereitung Hochsensitiver ELISA zur Erfassung der exogenen Induktion von östrogen abhängigen Dotterproteinen

Tier, anstatt invasiver Blutentnahme und Serumgewinnung keine Probenaufbereitung

3 Standardisierte eingeschlechtliche Testorganismen 1cm Eingeschlechtliche Bruten ( oder ) von Oreochromis niloticus werden von unseren Partnern an der Uni-Göttingen gezüchtet (lizenziert) und können ab einer Größe von 3cm in den Test eingesetzt werden. In Abhängigkeit von der Besatzdichte, wachsen die Fische innerhalb von 3 Wochen signifikant. Die gleichzeitige Bestimmung der Endpunkte Induktion von VG, Wachstum und Gonadendifferenzierung (z.b. Induktion von Testesova) ist in einem Assay weitgehend OECD konform möglich. Je nach Fragestellung sind Testmodifikationen mit eingeschlechtlich, oder / 1/1 Versuchsfischen möglich.

In Abhängigkeit von der Besatzdichte, wachsen die Fische innerhalb von 3 Wochen signifikant.

4 Reproduzierbare schonende Probennahme Hautabstrich vom lebenden Tier anstatt invasiver Blutentnahme, Serumgewinnung, oder Gewebsaufschluss Die Nahme von Schleimproben ist bei Fischen ab einer Größe von 3cm sicher und einfach durchführbar. Dazu werden die Fische mit einem kleinen Netz gefangen und sanft in der Hand fixiert. Der Schleim wird oberhalb der Seitenlinie mit einem Wattestäbchen schonend entnommen. Durch eine Sollbruchstelle oberhalb des Watteträgers kann die Probe kontaminationsfrei in ein mit Probenpuffer bestücktes Eppendorfgefäß überführt werden. Durch Schütteln der Probe (ggf. Vortex) wird die Benetzung der Watte und Überführung der Schleimproteine in den Probenpuffer gewährleistet. Die Proben können bei -20 C gelagert und ohne weitere Vorbereitung mittels Tilapa mucosa ELISA Testkit gemessen werden. Nach Exposition gegenüber 0,75ng Ethinylöstradiol/L ist nach 4 Tagen Expositionsdauer eine deutliche Erhöhung der VG Konzentration in der Probe um den Faktor 100 messbar.

Der Schleim wird oberhalb der Seitenlinie mit einem Wattestäbchen schonend entnommen.

5 Tilapia VG ELISA Die Tilapia Vitellogenin EIA Kit ist ein 96-Well-Immuno-Absorptions-ELISA Produkt. Serum oder Schleim-Proben werden in einer mit Vitellogenin spezifischem Antikörper beschichteten Mikrotiterplatte inkubiert. Nach Entfernung von ungebunden Material bindet ein biotinylierter Antikörper an Vitellogenin In dem folgenden Inkubationsschritt bindet ein Streptavidin-Peroxidase-Konjugat an den biotinylierten Antikörper. Die enzymatische Umsetzung des dargebotenen Peroxidasesubstrats geht mit einer Farbreaktion einher und erlaubt die Quantifizierung des Vitellogenins in Relation zu Standards.

Nach Entfernung von ungebunden Material bindet ein biotinylierter Antikörper an Vitellogenin In dem folgenden Inkubationsschritt bindet ein

6 Zur Durchführung des Assays werden Mehrkanalpipetten, Inkubatoren für Mikrotiterplatten mit Schüttelfunktion, Washer für 96 Well Microtiterplatten und ELISA Reader mit Auswertesoftware benötigt. Dienstleistungsangebot: Hausmethoden in Anlehnung an / Modifikation von OECD 204, OECD215, OECD 229, OECD 230, Draft FSDT, unter GLP Bedingungen mit chemisch analytischer Überprüfung der nominalen Testkonzentrationen Endpunkte: VG: ELISA/PCR, Aromatase: Enzymaktivität / PCR, Histopathologie Gonade, sekundäres Geschlechtsmerkmal 4 Tage Kurzzeittest zum Wirkstoff Screening Endpunkt VG ELISA, zur Differentialdiagnostik ist Bestimmung der östrogenen Wirkung im YES Assay möglich. VG Bestimmung aus TILAPIA Schleimproben, die mit GOBIO / Probennahemekit generiert wurden und histopathologische Untersuchungen von fremdexponierten Fischen (auch andere Spezies) führen wir als Auftragsanalytik durch. allner@gobio-gmbh.de

Testkonzentrationen Endpunkte: VG: ELISA/PCR, Aromatase: Enzymaktivität / PCR, Histopathologie Gonade, sekundäres Geschlechtsmerkmal 4 Tage Kurzzeittest zum Wirkstoff Screening Endpunkt VG ELISA, zur

7 Produktangebot: Standardisierte Testfische der Spezies Orechromis niloticus Probennahmetestkit mit Probenpuffer perforierten Wattestäben gereinigten Probengefäßen Flocked swap with breaking point ELISA-Testkit mit stabilen Standards Testlösungen immobilisierten/ biotinylierten Antikörpern können ab Oktober 2011 von GOBIO bezogen werden.

Flocked swap with breaking point ELISA-Testkit mit stabilen Standards Testlösungen

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