Western-Analyse Protein-Elektrophorese ELISA Protein-Chip

Transkript

1 Western-Analyse Protein-Elektrophorese ELISA Protein-Chip

2 DNA-RNA RNA-Protein

3 Die Struktur der DNA

4 Ebene der Proteinstruktur

5 Die Gruppen der Aminosäuren

6 Darstellung Räumliche R Proteinstrukturen (Röntgen ntgen- Krystallographie)

7 Proteinisolierung und Aufreinigung Lyse der Zellen/Gewebe (Detergens, Mechanisch; Hemmung der Proteasen) Aufreinigung (Zentrifugierung, Chromatographie) Probevorbereitung (Hängt von Zwecken ab; Elektrophorese: nativ-denaturierend; Enzymaktivität; t; Proteomik: 2-D-Elektrophorese) 2

8 Antigen-Antik Antikörper Antigen: Fremdes Material, welches Wirbeltiere erkennen und dagegen die B-Zellen des Immunsystems hochspezifische Antikörper bilden. Stärke der Antigene: Proteine> Polysaccharide > Lipide > Nukleinsaure. Antikörper: Proteine, die aus schwere- und leichte Ketten bestehen. Antikörper bilden spezifische Bindung mit dem Antigen. Nach der Immunisierung kann man sie aus dem gamma-globulin-fraktion des Blutserum isolieren.

9 Antikörper-Klassen

10 Kinetik der Antikörperbildung

11 Erzeugung monoklonaler Antikörper

12 Die auf Antigen-Antik Antikörper-Bindung gegründeten Verfahren Direktes Verfahren Primärer Antikörper trägt ein konjugiertes Protein, welches Detektierung ermöglicht Indirektes Verfahren Der sekundäre Antikörper erkennt die schwere Kette des primären Antikörpers und trägt konjugierten Teil (Enzym, fluoreszierende Verbindung) für Detektierung Affinität-Verfahren ( sandwich ) Kovalent-Bindung des primaren Antikörpers an Träger Chromatographie der Antigen-Lösung Bindung Elution des Antigens/Detektierung mit markierten Antikörper

13 Detektierung Antigen-Antik Antikörper Bindung Chromogener Substrat, Farbreaktion Fluorochrom Markierung, Fluoreszenz-Entstehung

14 Die Western-Analyse Während Western-analyse detektieren wir a. Die Grösse des Proteins (kd) b. Die Konzentration des Proteins

15 Poly-Akrylamid Akrylamid-Gelelektrophorese Vorbereitung der Probe: Denaturierung und Reduzierung mit SDS und -Merkapto-Ethanol, 3-5 Min, 90 o C Polyakrylamid-Gelelektrophorese (Sammler-Gel, Trennung-Gel) Elektrischer Transfer der Proteine auf Nitrozellulose (bindet Proteine mit hocher Affinität) A Kontrolle des Transfers (Färbung, Ponceau-red)

16 Polymerisierung von Akrylamid Achtung: Toxisch!!!!

17 Denaturierung von Proteine mit SDS SDS kezelés előtt Töltéssel rendelkező részek Betain-Struktur, Zwitterion Hidrofób részek SDS kezelés után Einheitlich negativgeladenes Protein

18 Vertikale Gelelektrophorese

19 Färbung getrennter Proteine

20 Farbstoff für f r FärbungF

21 Western-Analyse Membran-Blockierung Gesättigung unspezifischer Protein-Bindungsstellen mit Kasein oder BSA Inkubierung mit dem primären ren Antikörper Erkennung spezifischer Bindungsstellen 3x Waschen Inkubierung mit dem sekundären Antikörper z.b. horse-raddish raddish (Meerretich)-Peroxidase Peroxidase-Konjugat (HRP) 3x Waschen Detektierung Alkalische Phosphatase, HRP, ECL (Chemilumineszenz)

22 Elektro-Transfer

23 Kontrolle des Protein-Transfers: Ponceau-Färbung Elektro-Transfer

24 Ergebnis der Western-Analyse Ponceau: Färbt alle Proteine; Antikörper markiert das Zielprotein

25 ECL-Detektierung

26 Substrat für f r Alkalische Phosphatase

27 Bestimmung Lyme-Erkrankung mithilfe WesternAnalyse Zecke - Borrelia burgdorferi - bakterielle Proteine aus Blutserum

28 Beispiel für Lyme-Erkrankung Proben: 1: Molekulargewicht-Marker 2-3: Lyme-positiv-Sera 4-7: Diskriminierungsantikörper 8: Positive Kontrolle

29 Bestimmung Dystrophin-Protein

30 Protein-Chip Ligand-Chip Chip: : Mit spezifischer Antigen- Antikörper rper-bindung; Expressionsmuster- Bestimmung auf Protein-Ebene (DNA-Chip: Hybridisierung) Antikörper rper-bindungen auf Glass-Oberfl Oberfläche Anwendung: Forschung, Diagnose

31 Protein-Chip:Detektierung Antigen- Antikörper Wechselwirkungen

32 Muster von Hefeproteine

33 Chip-Automatisierung

34 ELISA-Verfahren ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, Enzym-gekoppeltes gekoppeltes-immunosorbenz-verfahren) Antigen wird auf festen Träger (Mikrotiter-Platte) gebunden Reaktion mit Serum der Patienten nach Verdünnungen Anwendung: Klinische Labordiagnose Bestimmung von Bakterien, Viren, Hormone, usw.

35 Die in ELISA angewandten Enzyme Enzyme und Substrate Meerettichperoxidase (HRP) Alkalische Phosphatase (AP) (Konjugiert mit dem AK) Substratmoleküle 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (HRP) 3,5-Dichloro-2-hydroxybenzenesulfonic acid (HRP) 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl phosphate, BCIP (AP) Indoxyl phosphate (AP) AP-BCIP-Farbreaktion

36 ELISA-Reaktion

37 Quantitative Ergebnisse von ELISA Positive Kontrolle Negatíve Kontrolle Patient A Patient B Patient C Test- Kontrolle O ELISA-Platte (Mikrotiterplatte)

38 Semiquantitative Bildanalyse Nach der Gelseparation von Proteine und Nukleinsären kann aus der Densität des Bandes (summierung der grauheitsstufen der Bildpunkte) auf dem grauen Gelbild eine quantitative Information gewonnen werden. Densität auf einem Pixel: Grauheitswert auf einem Pixel. 32 stufiger Durchgang 16 bit Graumatrix 8 bit (256 Farben) Durchgang 255 Wert = schwarz 0 Wert= weiss

39 Analyse der farbigen Aufnahmen geschieht aufgrund der Aufteilung auf RGB Farben Rot Grün Blau

40 Densitometrische Analyse des Gelbildes a) Profil b) Flächenanalyse Ablauf: Wir stellen das Querschnittprofil des Bandes her, mit der Subtraktion der Grunddensität des Gels kann aus der Flächengrösse unter der Kurve eine quantitative Schlussfolgerung gezogen werden. (Intensität/Pixel) Wir markieren ein, von dem Band etwas grösseren Gebiet. Wir bestimmen die Densitätsumme der Pixeln mit Grundintensität, welche aus der Summe der Pixeldensitätwerte des aktuellen Bandes subtraktiert wird